重組hCGβ乳酸桿菌構(gòu)建及其陰道免疫效能

引言

人絨毛膜促性腺激素β亞基（hCGβ）作為避孕疫苗的重要抗原，其單獨(dú)使用時(shí)的免疫原性較弱，難以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。盡管基于hCGβ的避孕疫苗已被證實(shí)安全、有效且避孕效果可逆，但其總有效率僅為80%-85%，不能在生殖道局部產(chǎn)生足夠的抗原特異性抗體，這可能是避孕效果不完整的主要原因。乳酸桿菌作為人體的正常菌群，在粘膜局部持續(xù)表達(dá)抗原可誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，因此被視為理想的疫苗載體。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建重組hCGβ乳酸桿菌，探索其經(jīng)陰道粘膜免疫的可行性，以期為開(kāi)發(fā)高效、安全的免疫避孕疫苗提供新的策略。

材料與方法

1. 材料

• 菌株與質(zhì)粒：短小乳酸桿菌、干酪氏乳酸桿菌Lactobacillus casei CECT5276、pCMV4-hCGβ質(zhì)粒、乳酸桿菌整合型表達(dá)載體pllac。

• 試劑：某品牌PCR試劑、某品牌DNA凝膠回收試劑盒、某品牌質(zhì)粒提取試劑盒、某品牌放免試劑、某品牌Western blotting試劑、某品牌ELISA試劑。

• 儀器：某品牌PCR儀、某品牌電泳儀、某品牌離心機(jī)、威尼德電穿孔儀、某品牌酶標(biāo)儀、某品牌Western blotting成像系統(tǒng)。

2. 方法

• 重組質(zhì)粒構(gòu)建：首先從短小乳酸桿菌基因組中PCR擴(kuò)增得到670bp的S-層蛋白表達(dá)信號(hào)序列，將其信號(hào)肽序列與hCGβ基因連接后克隆入乳酸桿菌整合型表達(dá)載體pllac的lac啟動(dòng)子下游，得到質(zhì)粒pllac-hCGβ。

• 電穿孔轉(zhuǎn)化：將pllac-hCGβ電穿孔轉(zhuǎn)化干酪氏乳酸桿菌Lactobacillus casei CECT5276，得到重組菌Lb casei hCGβ。通過(guò)PCR及測(cè)序分析外源基因在乳酸桿菌基因組中的整合情況。

• 誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定：在無(wú)選擇壓力條件下培養(yǎng)重組菌50代后，接種培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑乳糖，通過(guò)放免法檢測(cè)培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液中的hCGβ，Western blotting鑒定培養(yǎng)上清中的hCGβ蛋白。

• 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將穩(wěn)定、分泌性表達(dá)hCGβ的乳酸桿菌菌株經(jīng)陰道免疫8周齡BALB/c雌性小鼠，檢測(cè)重組菌在小鼠陰道局部的抗原分泌水平及陰道局部特異性IgA抗體水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 重組乳酸桿菌的構(gòu)建與鑒定

   通過(guò)PCR及測(cè)序分析，證實(shí)hCGβ基因已經(jīng)成功整合到Lb. casei的基因組中。重組菌產(chǎn)生的目的蛋白有78.5%分泌進(jìn)入培養(yǎng)上清。在加入誘導(dǎo)劑乳糖后21小時(shí)，上清中的hCGβ濃度達(dá)到峰值，為440mIU/ml。Western blot分析顯示22kDa的蛋白條帶，證實(shí)重組乳酸桿菌確實(shí)可分泌hCGβ蛋白抗原。

2. 重組乳酸桿菌的陰道免疫效能

   將重組乳酸桿菌接種于小鼠陰道后，第3、7天陰道洗液中可檢測(cè)到hCGβ，第14天陰道洗液中部分小鼠仍可檢測(cè)到hCGβ，說(shuō)明該重組菌可在陰道粘膜定居，并分泌hCGβ蛋白。通過(guò)ELISA法檢測(cè)陰道洗液中的抗hCGβIgA抗體水平，結(jié)果顯示，用不同劑量的重組菌經(jīng)陰道粘膜免疫小鼠后，陰道洗液中均可檢測(cè)到抗hCGβIgA抗體。

討論

1. 重組hCGβ乳酸桿菌的構(gòu)建意義

   本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌hCGβ的乳酸桿菌，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件優(yōu)化了hCGβ的分泌效率。這不僅為hCGβ在乳酸桿菌中的表達(dá)提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)免疫避孕疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2. 陰道粘膜免疫的機(jī)制與效果

   乳酸桿菌作為陰道的正常菌群，具有良好的安全性和免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)陰道粘膜免疫，重組乳酸桿菌能夠在生殖道局部產(chǎn)生高滴度的抗體，使抗生育作用更加直接、有效。本研究結(jié)果顯示，重組乳酸桿菌能夠有效誘導(dǎo)特異性IgA抗體的產(chǎn)生，驗(yàn)證了其作為免疫避孕疫苗載體的可行性。

3. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

   本研究創(chuàng)新地將hCGβ與乳酸桿菌結(jié)合，通過(guò)粘膜免疫途徑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，為免疫避孕疫苗的開(kāi)發(fā)提供了新的策略。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高h(yuǎn)CGβ的分泌量和穩(wěn)定性，并探討其在不同動(dòng)物模型中的免疫效果。此外，該策略還可能應(yīng)用于其他粘膜免疫相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定分泌hCGβ的乳酸桿菌，并通過(guò)陰道粘膜免疫小鼠驗(yàn)證了其免疫效能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組乳酸桿菌能夠在陰道粘膜局部定居并分泌hCGβ蛋白，有效誘導(dǎo)特異性IgA抗體的產(chǎn)生。這一研究不僅為hCGβ在乳酸桿菌中的表達(dá)提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效、安全的免疫避孕疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。未來(lái)的研究將繼續(xù)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，探討其在不同動(dòng)物模型中的免疫效果，并探索其在其他粘膜免疫相關(guān)疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用潛力。