精品推薦 | 低殘留、高性能分子診斷酶組合賦能RT-qPCR全預(yù)混體系開發(fā)！

隨著診斷試劑盒開發(fā)人員不斷要求降低檢測所需的樣本量，對 PCR/mNGS/tNGS等主流檢測方法的要求越來越高，需要更高的靈敏度來檢測目標(biāo)核酸。當(dāng)只有少數(shù)目標(biāo)分子可用時(shí)，市售的常規(guī)Taq DNA聚合酶里面含有的DNA基因組殘留導(dǎo)致的DNA污染的問題會(huì)加劇，微量的污染DNA可能會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，使得擴(kuò)增效率降低，影響陽性判斷值的確定，降低檢測試劑開發(fā)的靈敏度，給開發(fā)者帶來極大的阻礙和挑戰(zhàn)。

此外，當(dāng)檢測靶標(biāo)與擴(kuò)增體系里殘留的宿主DNA和外源核酸相關(guān)時(shí)，往往出現(xiàn)NTC和陰性樣本起峰的現(xiàn)象，影響最終結(jié)果判讀。

如圖1，樣本B的擴(kuò)增Ct值與NTC的越接近，結(jié)果就越不確定；好的結(jié)果需要NTC和樣本曲線之間有良好的分離。

如果樣本中的目標(biāo)物濃度越來越低，改進(jìn)檢測?法的有效途徑是將NTC曲線進(jìn)?步向右移動(dòng)（更大的Ct值）。使?潔凈的分子酶原料通常會(huì)將NTC曲線向右移動(dòng)，從?獲得更好的結(jié)果：

---來?相同樣本的檢測可靠性（即樣本與陰性對照的更好分離）；

---在相同確定性下檢測的下限進(jìn)一步提高（即樣本與?模板對照仍能分離，檢測到更低?平的?標(biāo)）。

圖1. 樣本A比樣本B濃度更高，但大多數(shù)樣本的?標(biāo)物或模板物濃度較低，更類似于樣本B，NTC越靠后，檢測靈敏度和可靠性更高

為達(dá)到早篩早診的目的，樣本濃度越來越低，宿主核酸和背景菌的干擾，容易導(dǎo)致漏檢或不確定結(jié)果，降低診斷試劑盒檢測的靈敏度和可靠性。

為了解決病原檢測中背景菌及宿主核酸殘留帶來的干擾問題，為臨床分子診斷試劑盒開發(fā) 、科研機(jī)構(gòu)等提供更潔凈、更高性能的分子酶原料，翌圣生物開發(fā)了的超低殘留去除技術(shù)，建立了遵循GMP標(biāo)準(zhǔn)的超潔凈分子酶生產(chǎn)基地-UCF.ME，以及嚴(yán)格按照ISO13485質(zhì)量管理體系進(jìn)行各環(huán)節(jié)把關(guān)，嚴(yán)控人（人員）、機(jī)（機(jī)器）、料（試劑、耗材）、法（工藝）、環(huán)（環(huán)境）、測（標(biāo)準(zhǔn)），有效的技術(shù)手段、潔凈的生產(chǎn)環(huán)境和嚴(yán)格的質(zhì)量控制結(jié)合，既控制外源性污染，又做好內(nèi)源性雜質(zhì)去除，從而實(shí)現(xiàn)超凈分子酶的開發(fā)目標(biāo)。這些分子酶原料的潔凈度相較常規(guī)商業(yè)產(chǎn)品高出幾個(gè)數(shù)量，是要求高靈敏度和可靠性的應(yīng)用中的理想選擇 。

圖2. 翌圣超低殘留分子酶質(zhì)量監(jiān)控流程圖

常規(guī)分子酶生產(chǎn)工藝需要的純化步驟多，且產(chǎn)量較低。制備低殘留高純度的分子酶產(chǎn)品時(shí)，產(chǎn)量與純度之間難以平衡，且可控性差，合格率低，因而導(dǎo)致批次間差異較大。翌圣生物開發(fā)的超低殘留去除技術(shù)純化步驟由繁變簡，有針對性的去除相關(guān)殘留，在精準(zhǔn)高效地去除殘留的同時(shí)，提高純化工藝的穩(wěn)定性與產(chǎn)量，降低批間差。

圖3. 翌圣超低殘留去除技術(shù)示意圖

翌圣生物是家以分子酶產(chǎn)品通過ISO 13485:2016質(zhì)量體系認(rèn)證的企業(yè)，從原料采購、生產(chǎn)管理、質(zhì)量控制、倉儲(chǔ)運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)都嚴(yán)格在質(zhì)量體系的監(jiān)管下開展，生產(chǎn)、檢驗(yàn)過程實(shí)施動(dòng)態(tài)監(jiān)控，對現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)人的著裝、設(shè)備的狀態(tài)、物料的進(jìn)出、方法的確認(rèn)、環(huán)境的維護(hù)、測量的運(yùn)行等方面的問題，分析產(chǎn)生的具體原因，協(xié)助責(zé)任部門共同完成整改，以保證生產(chǎn)、檢驗(yàn)操作，按照標(biāo)準(zhǔn)SOP進(jìn)行，有據(jù)可依，有章可循，為持續(xù)輸出質(zhì)量穩(wěn)定的、滿足法規(guī)和顧客需求的產(chǎn)品，提供質(zhì)量保證。

圖4. 翌圣ISO13485認(rèn)證超潔凈分子酶生產(chǎn)基地

同時(shí)，使用翌圣生物自研的高靈敏度E.coli 宿主細(xì)胞 DNA 殘留檢測試劑盒在不同階段精心追蹤分子酶樣品，最大限度降低最終分子酶產(chǎn)品核酸污染的風(fēng)險(xiǎn)。

鑒于目前分子診斷試劑盒開發(fā)企業(yè)對于DNA/RNA全預(yù)混熒光定量PCR原料的迫切需求，諸多研究人員都在研究過程中發(fā)現(xiàn)使用低殘留的分子酶原料，開發(fā)全預(yù)混體系的成功率更高。

此外，在常規(guī)酶原料和低殘留酶原料的篩選、測試過程中，研發(fā)人員發(fā)現(xiàn)低殘留原料對于部分體系的檢測性能有提高，如Ct值提前等。

翌圣生物推出了全套低殘留酶原料，包括 Taq DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、UDG 酶、RNase 抑制劑及適配 buffer 組分，旨在滿足科研和工業(yè)用戶開發(fā)更潔凈、高性能分子診斷試劑盒的需求。適用于以下應(yīng)用體系的開發(fā)：

部分性能展示：

圖6. 分別使用低殘留和常規(guī)的Taq DNA聚合酶、UDG酶，搭配相同的反應(yīng)buffer，和HPV、內(nèi)標(biāo)引探與所有試劑組分提前預(yù)混，在37℃條件下放置7天，與-20℃正常保存的試劑，同時(shí)檢測濃度為10 拷貝/微升的模板，結(jié)果顯示，常規(guī)單酶在熱加速處理后熒光值會(huì)出現(xiàn)不同程度的降低，而低殘留單酶在37℃加速7天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴(kuò)增曲線峰形、熒光值、Ct值都沒有變化，穩(wěn)定性更高。

圖7. 使用低殘留逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、UDG酶和RNase抑制劑，配置成RT-qPCR體系，將各類靶標(biāo)引探與所有試劑組分提前預(yù)混，在37℃條件下放置5天，與-20℃正常保存的試劑同時(shí)擴(kuò)增Ct值35左右的模板核酸，結(jié)果顯示，該體系在37℃加速5天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴(kuò)增曲線峰形、熒光值、Ct值基本沒有變化，檢出率一致，RNA全預(yù)混體系穩(wěn)定性高。