關于蛋白質沉淀鹽析方法探究

        蛋白質通過鹽析的辦法沉淀的原理是降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出。蛋白質的沉淀（protein precipitation），沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。蛋白質從溶液中析出的現象，稱為蛋白質的沉淀。蛋白質沉淀常用的方法有鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、生物堿試劑與某些酸沉淀等。

        在生化制備中，沉淀主要用于濃縮目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的鹽析法多用于各種蛋白質和酶的分離純化。
   一般來說，所有固體溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程叫鹽析。在生化制備中,許多物質都可以用鹽析法進行沉淀分離，如蛋白質、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質沉淀最為常見，特別是在粗提階段。
      鹽析法分為兩類，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現，用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現，用于后期進一步分離純化和結晶。

一．影響鹽析的若干因素
        1．蛋白質濃度
高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質的b 和Ks常數十分接近，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進行適當選擇。用于分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至zui 低限度。一般認為2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。
       2．離子強度和類型
　　一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。
   離子種類對蛋白質溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。
   3．PH值
　　一般來說，蛋白質所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調到目的蛋白的等電點處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同的，需根據實際情況調整溶液PH值，以達到好的鹽析效果。
   4．溫度
　　在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。

二．硫酸銨的使用
　　硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用硫酸調節(jié)至所需PH。
硫酸銨的加入有以下幾種方法：
1）、加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；
2）、加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；
3）、透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，透析袋內硫酸銨飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測量飽和度，故多用于結晶，其它情況少見。
使用固體硫酸銨時：
1）、必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；
2）、分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質濃度的變化。一種蛋白質如經二次透析，一般來說，第一次鹽析分離范圍（飽和度范圍）比較寬，第二次分離范圍較窄。
3）、鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。