動(dòng)物源性食品中細(xì)菌的檢測(cè)——大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）習(xí)慣上稱為大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬，并且大腸桿菌株ATCC 11775是該屬的模式菌種。大腸桿菌的不同菌株間DNA相關(guān)性為80%，而與同科的志賀氏菌屬（除鮑氏志賀氏菌外）的DNA相關(guān)性可達(dá)80%～87%。大腸桿菌常見(jiàn)于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，大多數(shù)血清型的大腸桿菌并不致病，而且是腸道內(nèi)常在的有益菌。

致病性大腸桿菌是通過(guò)環(huán)境污染進(jìn)入食品中的，有些血清型的致病性大腸桿菌感染食品，某些菌株具有毒性（其中一些類似導(dǎo)致痢疾的毒素），可以導(dǎo)致食物中毒，這通常是因?yàn)槭秤昧吮晃廴镜娜忸惍a(chǎn)品等（通常是屠宰過(guò)程或儲(chǔ)藏過(guò)程中的污染所致）。疾病的嚴(yán)重程度可以相差很多，尤其對(duì)兒童、老人和免疫缺失病人可以是致命的，但通常是溫和的。大腸桿菌的內(nèi)毒素可能對(duì)熱穩(wěn)定或不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)和功能與霍亂毒素相當(dāng)接近，全毒素包含1個(gè)A亞基和5個(gè)B亞基，B亞基起黏附作用，使毒素進(jìn)入腸道細(xì)胞，而A亞基斷裂出來(lái)，使得細(xì)胞脫水引起腹瀉。不同的大腸桿菌菌株生活在不同動(dòng)物中，因此可以通過(guò)其判斷糞便來(lái)源于人或者鳥(niǎo)類等。通過(guò)突變，新的大腸桿菌菌株不斷出現(xiàn)，其中一些可能對(duì)宿主動(dòng)物造成損害。盡管對(duì)于大多數(shù)健康成年人，這樣的菌株可能只引起一次腹瀉，或者根本沒(méi)有癥狀，但對(duì)于幼兒、大病初愈的人或者進(jìn)行某些藥物治療的人來(lái)說(shuō)，陌生的菌株可能引起嚴(yán)重疾病甚至死亡。

與人類疾病有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，一般包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）和黏附性大腸桿菌（EAEC）。腸出血性大腸桿菌O157：H7就是一個(gè)毒性很強(qiáng)的菌株，屬埃希氏菌屬的一種血清型。在1982年，美國(guó)從漢堡包集體食物中毒事件中發(fā)現(xiàn)食物中毒由大腸桿菌所致，大約10個(gè)細(xì)菌即可導(dǎo)致感染，這是迄今為止能引起食物中毒的最小菌量。致病性大腸桿菌可經(jīng)帶菌人的手、食物和生活用品進(jìn)行傳播，也可經(jīng)空氣或水源傳播。帶菌食品由于加熱不或因生熟交叉污染或熟后污染而引起食物中毒。另外，大腸桿菌耐酸，即便在胃的酸性條件下也能存活。它在水中生存的時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)。美國(guó)每年約有20000人染上腸出血性大腸桿菌病，其中約有50人死于該病。大腸桿菌是美國(guó)碎牛肉中必須控制的目標(biāo)菌。

1、病原學(xué)特征

大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，大小為0.5μm×（1～3）μm。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動(dòng)能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長(zhǎng)，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對(duì)人體的危害，還能合成B族維生素和維生素K及有殺菌作用的大腸桿菌素。大腸桿菌在正常棲居條件下不致病，但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道中大量繁殖，幾乎占糞便干重的1/3。兼性厭氧菌。在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下，常隨糞便散布在周圍環(huán)境中。若在水和食品中檢出該菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。因此大腸菌群數(shù)（或大腸菌值）常作為飲水和食物（或藥物）的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家規(guī)定，每升飲用水中大腸桿菌數(shù)不應(yīng)超過(guò)3個(gè)）。

大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），表面抗原有抗機(jī)體吞噬和抗補(bǔ)體的能力。根據(jù)菌體抗原的不同，可將大腸桿菌分為150多型，其中有16個(gè)血清型為致病性大腸桿菌，常引起流行性嬰兒腹瀉和成年人肋膜炎。大腸桿菌是研究微生物遺傳的重要材料，如局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)就是1954年在大腸桿菌K12菌株中發(fā)現(xiàn)的。萊德伯格（Lederberg）采用兩株大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行試驗(yàn)，奠定了研究細(xì)菌接合方法學(xué)上的基礎(chǔ)及基因工程的研究。

該菌對(duì)熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55℃經(jīng)60min或60℃加熱15min仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。膽鹽、煌綠等對(duì)大腸桿菌有抑制作用。該菌對(duì)磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，但易耐藥，是由帶有R因子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而獲得的。

2、流行病學(xué)特征

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道等處的常在菌，1g糞便中約含有106個(gè)菌。該菌在飲水中出現(xiàn)被認(rèn)為是糞便污染的指標(biāo)。禽大腸桿菌在雞場(chǎng)中普遍存在，特別是雞舍通風(fēng)不良、大量積糞時(shí)，在墊料、空氣塵埃、污染用具和道路，糞場(chǎng)及孵化廳等處環(huán)境中染菌量。大腸桿菌隨糞便排出，并可污染蛋殼或從感染的卵巢、輸卵管等處侵入卵內(nèi)，在孵育過(guò)程中使禽胚死亡或出殼發(fā)病和帶菌，是該病傳播過(guò)程中重要途徑。帶菌禽以水平方式傳染健康禽，消化道、呼吸道為常見(jiàn)的傳染門戶，也可經(jīng)生殖道造成傳染。嚙齒動(dòng)物的糞便常含有致病性大腸桿菌，可污染飼料、飲水而造成傳染。禽大腸桿菌病主要發(fā)生在密集化養(yǎng)禽場(chǎng)，各種禽類不分品種、性別、日齡均對(duì)該菌易感。特別是幼齡禽類發(fā)病率，如污穢、擁擠、潮濕通風(fēng)不良的環(huán)境，過(guò)冷過(guò)熱或溫差很大的氣候，有毒有害氣體（氨氣或硫化氫等）長(zhǎng)期存在，飼養(yǎng)管理失調(diào)，營(yíng)養(yǎng)不良（特別維生素的缺乏）以及病原微生物（如支原體及病毒）感染所造成的應(yīng)激等均可促進(jìn)該病的發(fā)生。

人可通過(guò)飲用受污染的水或食用未熟透的食物（特別是免治牛肉、漢堡扒及烤牛肉）而感染，出現(xiàn)腹瀉等癥狀。飲用或食用未經(jīng)消毒的奶類、芝士、蔬菜、果汁及奶酪而染病的個(gè)案亦有發(fā)現(xiàn)。此外，若個(gè)人衛(wèi)生欠佳，亦可能會(huì)通過(guò)人傳人的途徑，或經(jīng)食用受糞便污染的食物而感染該種病菌。

由于大腸桿菌是人及各種動(dòng)物腸道中的正常寄居菌，常隨糞便從人及動(dòng)物體中排出，廣泛散播于自然界，所以一旦檢出大腸桿菌，即意味著所檢樣品直接或間接地被糞便污染，因此衛(wèi)生學(xué)上被用于作為飲水、牛奶或食品等的糞源性污染衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)指標(biāo)；并且由于大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道病原菌相近，它的出現(xiàn)也可能預(yù)示著某些腸道病原菌（例如沙門氏菌、志賀氏菌）的存在，因此該細(xì)菌是的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。有些國(guó)家在執(zhí)行危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn)（HACCP）管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。

3、危害

致瀉性大腸桿菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例為引起的腹瀉病例數(shù)量始終位于第二位，可見(jiàn)大腸桿菌腸道傳染的廣泛性。另外，致瀉性大腸桿菌亦可常年引發(fā)人體腹瀉，以夏秋季節(jié)為高峰，在患者感染住院率中，嬰幼兒占60%以上。近來(lái)，EHEC O157：H7被WHO定為新的食源性致病菌，其可引發(fā)出血性腸炎的暴發(fā)或散發(fā)病例。1982年美國(guó)報(bào)道了由腸出血性大腸桿菌O157：H7引起的出血性腸炎暴發(fā)。此后，世界各地陸續(xù)報(bào)道了該菌引起的感染，感染病例數(shù)并有上升趨勢(shì)。1996年在日本發(fā)生的腸出血性大腸桿菌O157：H7的暴發(fā)流行引起了出血性腹瀉，先后波及日本30多個(gè)都、府、縣，感染近萬(wàn)人，并造成12人死亡，引起了的關(guān)注。此外，美國(guó)、加拿大、瑞典、澳大利亞、英國(guó)的蘇格蘭和威爾士等國(guó)家和地區(qū)也相繼報(bào)道了腸出血性大腸桿菌O157：H7的散發(fā)性感染和暴發(fā)流行。日本、加拿大及瑞士等國(guó)家已將腸出血性大腸桿菌O157：H7列為必須報(bào)告的傳染病，予以高度重視。我國(guó)于1988年分離到腸出血性大腸桿菌O157：H7，從已有的流行病調(diào)查資料來(lái)看，我國(guó)亦存在腸出血性大腸桿菌O157：H7的散發(fā)病例，但尚未有暴發(fā)流行的報(bào)道。

4、國(guó)內(nèi)外衛(wèi)生要求

美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)中規(guī)定大腸桿菌在雞肉、牛肉和豬肉中的分別為m＝100CFU/cm2、M＝1000CFU/cm2（雞肉），m≤5CFU/cm2、M＝100CFU/cm2（牛肉），m＝10CFU/cm2、M＝10000CFU/cm2（豬肉）；（m是指合格菌數(shù)，M是指附加條件后合格菌數(shù)）加拿大在新鮮或冷凍禽肉標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定大腸埃希氏菌的為m＝10CFU/cm2、M＝1000CFU/cm2；歐盟的食品微生物法規(guī)匯編中規(guī)定碎肉或冷凍碎肉中的大腸埃希氏桿菌的為m＝50CFU/cm2、M＝500CFU/cm2；澳大利亞食品標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)中規(guī)定生乳或未經(jīng)巴氏消毒的乳中大腸桿菌的為m＝3CFU/mL、M＝9CFU/mL。在我國(guó)的動(dòng)物源性食品標(biāo)準(zhǔn)中，除了凍禽產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了致瀉性大腸桿菌不得檢出外，其他所有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)只是規(guī)定了大腸菌群的。

5、檢測(cè)方法

包括病原的分離鑒定及分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等。

5.1 細(xì)菌分離鑒定方法

5.1.1 增菌

以無(wú)菌操作將待檢樣品放入營(yíng)養(yǎng)肉湯中均質(zhì)，制成懸液，于（36±1）℃培養(yǎng)16h。

5.1.2 分離

將肉湯增菌液接種于麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板上；污染嚴(yán)重的樣品，制成懸液后可直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板；也可接種于顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)16～20h，觀察菌落。從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落，用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h，以備進(jìn)行生化試驗(yàn)。

5.1.3 革蘭氏染色

取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物做革蘭氏染色、鏡檢，大腸桿菌為革蘭氏陰性桿菌。

5.1.4 生化鑒定

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面菌落分別接種于三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、半固體、pH7.2尿素瓊脂、肉湯，并置（36±1）℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

三糖鐵底層產(chǎn)酸，硫化氫陰性，陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸桿菌。

5.1.5 血清學(xué)分型

挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸桿菌的菌落，用大腸桿菌多價(jià)O血清和腸出血性大腸桿菌O157血清做玻片凝集試驗(yàn)。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)O血清做凝集試驗(yàn)。

5.2 生化鑒定試劑盒方法

API20E試驗(yàn)條由20個(gè)含干燥底物的小管所組成。這些測(cè)定管用細(xì)菌懸浮液接種。培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)代謝作用產(chǎn)生顏色的變化，或是加入試劑后變色而觀察其結(jié)果。

挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上單個(gè)純菌落于滅菌純水中，制成菌懸液。按照生化鑒定試劑盒操作說(shuō)明，將菌懸液加入20E反應(yīng)條的各反應(yīng)孔內(nèi)，放入反應(yīng)槽中，置37℃溫箱中培養(yǎng)24h。取出后根據(jù)說(shuō)明書觀察反應(yīng)結(jié)果，在軟件上記錄結(jié)果，系統(tǒng)將自動(dòng)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果。所得反應(yīng)的類型必須以數(shù)字化形式記錄在報(bào)告單中，每3個(gè)測(cè)定為一組，每個(gè)以1、2和4標(biāo)明，在每組中，陽(yáng)性反應(yīng)以相應(yīng)的數(shù)字相加，由API20E的20個(gè)測(cè)定可得一個(gè)7位數(shù)。

5.3 分子生物學(xué)方法

從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用無(wú)菌去離子水制成菌懸液，水浴煮沸10分鐘，3000r/min離心，以上清液為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為5′-TGT TCA GTG GCA AGA GTT-3′，下游引物為5′-TAA TCG ATA TAC CCG CTC-3′；擴(kuò)增體系：10×buffer5μL，Taq DNA聚合酶（2U/μL）1μL，氯化鎂溶液（25mmol/L）5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，雙蒸水（ddH2O）29μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，模板1μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共作用36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用15%的瓊脂糖在100V條件下進(jìn)行電泳，得到擴(kuò)增長(zhǎng)度為353bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，可鑒定該菌為大腸桿菌。

5.4 VIDAS鑒定腸出血性大腸桿菌O157方法

VIDAS鑒定腸出血性大腸桿菌O157（ECO）方法是一種在自動(dòng)VIDAS儀器上進(jìn)行的酶聯(lián)熒光免疫分析的方法。其原理是：煮沸過(guò)的增菌肉湯加入試劑條孔后，在特定時(shí)間內(nèi)，樣品在固相容器（用抗腸出血性大腸桿菌O157抗體包被一個(gè)類似于加樣頭的一次性使用裝置）內(nèi)、外反復(fù)循環(huán)。樣品中的O157抗原與包被在固相容器內(nèi)部的O157抗體結(jié)合，未結(jié)合的其他成分通過(guò)洗滌步驟清除。標(biāo)記有堿性磷酸酶的抗體也在固相容器內(nèi)、外循環(huán)并與固定在固相容器壁上的腸出血性大腸桿菌O157抗原結(jié)合，最后洗去未結(jié)合的抗體標(biāo)記物。仍結(jié)合在固相容器壁上的酶將催化底物轉(zhuǎn)變成具有熒光的產(chǎn)物4-甲基傘形酮，在VIDAS中由光掃描器在450nm處檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)完成后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析結(jié)果，得出檢測(cè)值，并打印出每份樣品的試驗(yàn)報(bào)告。其檢測(cè)步驟如下：

挑取腸出血性大腸桿菌O157可疑菌落，放入1mL無(wú)菌純水中制成菌懸液，或直接取1mL培育24h的增菌液，置水浴鍋中95～100℃煮沸15min后，冷卻至室溫，同時(shí)設(shè)質(zhì)控對(duì)照并煮沸、冷卻，以備檢測(cè)。

（1）將所需試劑取出，使其恢復(fù)至室溫（至少30分鐘）。

（2）每個(gè)樣品使用一條ECO試劑條及一個(gè)ECO固相容器，先必須做好質(zhì)控和校正。確保取出試劑后，將裝有剩余固相容器的袋子重新密封好。

（3）輸入所需的信息以便建立工作列表（work list），鍵入“ECO”至檢測(cè)編號(hào)，再輸入將要檢測(cè)的試驗(yàn)號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)（S1）必須在work list的并做雙份，隨后是質(zhì)控（C1和C2）。

（4）使用前混勻標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控及滅活的樣品。準(zhǔn)確吸取500μL以確保測(cè)試的正確性。

（5）吸取500μL的質(zhì)控及滅活的樣品至ECO試劑條樣品孔的。

（6）依屏幕所示，將固相容器和試劑條放入儀器的相應(yīng)位置。核對(duì)位置，以確保固相容器上3個(gè)字母編碼的顏色標(biāo)記與試劑條相符。

（7）檢測(cè)結(jié)束后，儀器自動(dòng)打印檢測(cè)結(jié)果。

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