干貨 | 一文說清TOPO克隆與同源重組克隆之間的區(qū)別！

隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進化提供新的力量。

但有時候選擇多，反而讓人頭大！

市面上常用的TOPO克隆與同源重組克隆，到底應(yīng)該選擇哪一個克隆技術(shù)用于自己的實驗?zāi)?？今天小翌就來給各位科研er們科普一下二者之間的區(qū)別。

基于拓撲異構(gòu)酶I（Topoisomerase I）的DNA克隆方法，該酶同時具有限制性內(nèi)切酶活性和連接酶活性，能夠識別特定DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切雙鏈DNA，使得Topo酶與3'末端形成共價鍵。在連接反應(yīng)中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng)。

TOPO克隆原理

目前市面上的產(chǎn)品，需根據(jù)DNA片段末端的不同，選擇不同的TOPO克隆試劑盒。如果高保真酶擴增片段，獲得的片段即為平末端，可以選擇TOPO-Blunt試劑盒（翌圣Cat#10909ES、Cat#10910ES）。如果Taq酶擴增片段，獲得的片段即為粘性末端，可以選擇TOPO-TA試劑盒（翌圣Cat#10907ES、Cat#10908ES）。翌圣新一代兼容型TOPO-TA/Blunt克隆酶（Cat#10906ES），可以無視擴增后片段末端的區(qū)別，室溫反應(yīng)5 min即可連接上TOPO載體，陽性克隆率接近100%。

翌圣兼容型TOPO克隆原理

基于同源重組酶的定向克隆技術(shù)。首先將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶（T5核酸外切酶切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶通過15-25 bp的同源序列互補配對，Taq連接酶修復(fù)缺口）的作用下，經(jīng)過一定的時間和溫度即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。

同源重組原理

同源重組酶可連接單片段或者多片段，根據(jù)插入片段數(shù)的不同，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒。翌圣的Hieff Clone®系列一步法克隆試劑盒，最快僅需50℃反應(yīng)5 min即可轉(zhuǎn)化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。其中，翌圣10911ES試劑可連接單片段，該試劑盒已發(fā)文章累計IF達到1000+。10923ES試劑可連接1-7片段，最長連接片段可達27 kb，是多片段連接。值得注意的是，同源重組技術(shù)同樣可以無視擴增后片段末端的區(qū)別，直接進行載體、片段連接。

翌圣單/多片段克隆連接原理

翌圣Hieff Clone® TOPO克隆系列試劑，僅需添加100 bp-5 kb目的片段，室溫反應(yīng)5 min，即可完成克隆，且無需藍白斑篩選。

翌圣Hieff Clone®一步法克隆系列試劑，僅需添加線性化載體、目的片段，50℃反應(yīng)5-50 min，即可完成1-7片段的一步克隆。

那么兩種克隆技術(shù)都是載體和片段的連接，應(yīng)該如果選擇呢？

小翌建議大家可以根據(jù)應(yīng)用場景的不同，選擇不同的克隆試劑盒。

• 浙江大學(xué)：100 bp-500 bp粘性末端連接，陽性率100%！

• 同濟大學(xué)：10923ES連接3片段，陽性率100%！