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使用正交供體-受體小分子染料構(gòu)建兩性離子晶狀納米聚集體實(shí)現(xiàn)協(xié)同光療
本文要點(diǎn)：開發(fā)小分子染料聚集的納米光敏劑（nanoPS）用于協(xié)同光療，是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中引人注目的前沿研究。但目前，對(duì)分子結(jié)構(gòu)、組裝行為和治療功能之間相互作用的研究有限。在這里，引入了“晶體聚集體中的自旋軌道電荷轉(zhuǎn)移系間躍遷（SOCT-ISC）”的概念，能夠顯著增強(qiáng)小分子nanoPS的光動(dòng)力（PD）和光熱（PT）特性。具體而言，在含有三氰基呋喃（TCF）陰離子七甲川青（TCF-Cy7-TCF）染料的中位位置引入了一個(gè)陽離子吡啶（Py）基團(tuán)，以構(gòu)建一個(gè)正交電荷轉(zhuǎn)移二聯(lián)體（TCF-Cy7(Py)-TCF），通過SOCT-ISC機(jī)制增強(qiáng)三重態(tài)的形成以增強(qiáng)PD特性。雙性離子基團(tuán)賦予TCF-Cy7(Py)-TCF即使在超低濃度下也具有高結(jié)晶度，決定了其在聚集體中的堆積行為，并增強(qiáng)了PT和PD特性。與TCF-Cy7-TCF相比，TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體表現(xiàn)出更高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率（0.8% vs 0.2%）和光熱轉(zhuǎn)換效率（55.06% vs 7.78%）。令人印象深刻的是，TCF-Cy7(Py)-TCF優(yōu)先積聚在腫瘤部位，在NIR-I和NIR-II窗口中實(shí)現(xiàn)了高信噪比的腫瘤成像，并且非特異性結(jié)合極少。最終，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體作為協(xié)同光療的nanoPS功能，為設(shè)計(jì)單組分PS用于臨床轉(zhuǎn)化提供了一種簡(jiǎn)單而有效的策略。
研究者提出了一種利用“晶體納米聚集體中的SOCT-ISC”的方法，將SOCT-ISC的優(yōu)勢(shì)與PS的超分子組裝結(jié)合到一個(gè)統(tǒng)一的納米平臺(tái)中。在本研究中，通過將吡啶陽離子（Py）引入到對(duì)稱陰離子Cy7（TCF-Cy7-TCF）的中位位置構(gòu)建了一個(gè)雙性離子二聯(lián)體（TCF-Cy7(Py)-TCF）。這個(gè)二聯(lián)體可以在水溶液中以極低的濃度自組裝成納米聚集體，而不需要穩(wěn)定劑和賦形劑（圖1）。通過這種設(shè)計(jì)，由于PS的正交幾何結(jié)構(gòu)的自組裝限制了輻射衰減，TCF-Cy7(Py)-TCF的光熱轉(zhuǎn)換效率和ROS生成顯著優(yōu)于市售的ICG以及類似的TCF-Cy7-TCF。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF在聚集體中松散堆積，這可以優(yōu)化非輻射衰減，并有助于增強(qiáng)PTT和PDT性能。具有雙性離子性質(zhì)的TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體通過增強(qiáng)了的滲透和滯留（EPR）效應(yīng)表現(xiàn)出超低的非特異性組織攝取和高腫瘤積累。使用皮下腫瘤小鼠模型證實(shí)，TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體不僅提供精確的光聲（PA）和近紅外（NIR）熒光成像，還通過“晶體納米聚集體中的SOCT-ISC”機(jī)制表現(xiàn)出PTT/PDT協(xié)同效應(yīng)，為設(shè)計(jì)先進(jìn)的光治療劑提供了新的分子指導(dǎo)。
圖2. TCF-Cy7（Py）-TCF及其母體分子TCF-Cy7-TCF的光物理性質(zhì)。
TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的穩(wěn)態(tài)紫外-可見-近紅外（UV-Vis-NIR）吸收光譜進(jìn)行了研究（圖2）。在有機(jī)溶劑如甲醇（MeOH）中，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的吸收（圖2a,b）和熒光（圖2c）光譜與相關(guān)的TCF-Cy7-TCF染料非常相似。具體而言，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體在甲醇中的吸收光譜在904 nm處顯示出一個(gè)強(qiáng)烈的峰值，相比于TCF-Cy7-TCF（888 nm）發(fā)生了紅移（圖2b）。此外，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的熒光光譜也相應(yīng)地紅移（圖2c），但其Stokes位移保持不變。對(duì)于TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的主要發(fā)色團(tuán)，獲得了類似的ESP分布，負(fù)區(qū)域出現(xiàn)在兩側(cè)的TCF基團(tuán)中，而正區(qū)域集中在Cy7的多亞甲基橋中，表明它們具有高度對(duì)稱的電子結(jié)構(gòu)（圖2d）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的Py基團(tuán)上出現(xiàn)了一個(gè)極度正的區(qū)域，表明Py基團(tuán)具有強(qiáng)烈的電子吸引特性（圖2d）。為了進(jìn)一步可視化電荷轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)，進(jìn)行了飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）測(cè)量（圖2f，g）。在780 nm的脈沖激光激發(fā)下，水中的TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體均在其最大吸收處顯示出明顯的負(fù)吸收帶，這被歸因于基態(tài)漂白（GSB）。對(duì)于TCF-Cy7-TCF（40 µm），在≈570 nm處觀察到激發(fā)態(tài)吸收（ESA）帶（圖2f），這歸因于1TCF-Cy7-TCF態(tài)，其衰減時(shí)間僅為≈96 ps（圖2h）。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體（40 µm）在1.11 ps內(nèi)在≈600 nm處呈現(xiàn)出一個(gè)特別顯著的峰值，這可以歸因于CTS（TCF-Cy7-TCF–Py+?，圖2g）。其衰減動(dòng)力學(xué)在納秒時(shí)間尺度上（>3 ns）未顯示出恢復(fù)，這表明具有慢電荷重組的長(zhǎng)壽命CTS可以優(yōu)先松弛到激發(fā)的T1態(tài)（圖2h）。
圖3. TCF-Cy7（Py）-TCF 在水溶液中的自組裝和光療性能
使用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）對(duì)水中的明顯聚集體進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)TCF-Cy7-TCF僅表現(xiàn)出有限的聚集，未形成納米聚集體。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF形成了平均水動(dòng)力直徑約為155 nm的納米聚集體。這樣的納米聚集體非常穩(wěn)定，在水或補(bǔ)充血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)后不會(huì)沉淀或形成大塊（圖3a）。透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體的形態(tài)為規(guī)則的球形納米粒子，平均大小約為140 nm（圖3b）。使用高倍TEM進(jìn)一步研究了納米粒子中TCF-Cy7(Py)-TCF分子的堆積模式，顯示存在一些小的超分子晶體域（圖3c）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米粒子的粉末X射線衍射圖譜顯示了與其單晶相似的圖譜，表明TCF-Cy7(Py)-TCF分子的排列方式類似于其單晶中的排列（圖3d）。此外，原子力顯微鏡（AFM）顯示納米粒子具有清晰的圓形邊緣，其厚度/直徑比遠(yuǎn)小于1，表明其結(jié)構(gòu)類似于二維結(jié)構(gòu)的納米碟（圖3e）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF能夠在低至35 nm的濃度下形成這樣的納米碟，這種超低臨界膠束濃度（CMC）表明納米碟在臨床相關(guān)濃度下可能比商業(yè)膠束更穩(wěn)定。
接著研究了TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在激光照射下產(chǎn)生高熱或ROS的能力。在近紅外（NIR）照射下（808 nm, 1.0 W cm?2）10分鐘，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的溶液溫度分別在10、20和40 µm的濃度下增加到47.6、54.0和59.5 °C（圖3f）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的光熱轉(zhuǎn)換效率（η）值為55.06%，顯著高于TCF-Cy7-TCF（7.78%）（圖3g）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的產(chǎn)熱能力在連續(xù)五次輻照-冷卻循環(huán)后保持一致（圖3h），表明其光熱穩(wěn)定性優(yōu)于TCF-Cy7-TCF。如圖3i所示，DPBF在NIR照射（808 nm，0.3 W cm?2）下迅速降低吸收，表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟產(chǎn)生了ROS，而單獨(dú)的DPBF在相同照射5分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3j）。然后確定DPBF的分解速率常數(shù)（圖3k），計(jì)算出TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在水中的Φ?為0.8%，是ICG的四倍。同時(shí)，在水中具有有限聚集但缺乏正交Py的TCF-Cy7-TCF的Φ?測(cè)量值為0.21%，略高于相同條件下的ICG。使用 “聚集體中的SOCT-ISC”機(jī)制，該機(jī)制將SOCT-ISC的益處與PS的超分子組裝集成到一個(gè)平臺(tái)中，實(shí)現(xiàn)高效的PTT/PDT。
圖4. TCF-Cy7（Py）-TCF 納米碟在腫瘤細(xì)胞中的光療性能
圖4a中的黃色熒光表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟與溶酶體的共定位，得到的Pearson相關(guān)系數(shù)（Rr）約為92%。相比之下，4T1細(xì)胞中TCF-Cy7-TCF和LysoTracker Green的Rr僅為73%，表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟和TCF-Cy7-TCF通過不同的途徑被細(xì)胞內(nèi)化。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明TCF-Cy7-TCF表現(xiàn)出有限的聚集，并且不形成大尺寸的納米粒子。
通過商業(yè)試劑確定細(xì)胞中由照射介導(dǎo)的ROS生成。在近紅外（NIR）照射（808 nm, 0.3 W cm?2）下，使用TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟處理的4T1細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光，這種熒光增強(qiáng)被ROS清除劑維生素C（Vc）顯著抑制。相比之下，在用TCF-Cy7-TCF或PBS處理的對(duì)照組中，無論是否激光照射，均未檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)（圖4b）。結(jié)果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在NIR照射下具有在細(xì)胞中生成ROS的強(qiáng)大能力，使其非常適合用于PDT。
為了驗(yàn)證增強(qiáng)的PDT和PTT的協(xié)同效應(yīng)，使用等濃度的TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟或TCF-Cy7-TCF（12.5 µm）處理4T1細(xì)胞，進(jìn)行LIVE/DEAD染色試驗(yàn)。結(jié)果顯示，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在單模式（單一PTT或PDT）和協(xié)同光療（圖4c）中均表現(xiàn)出優(yōu)于TCF-Cy7-TCF的效果，同時(shí)具有良好的生物相容性（圖4d）。隨后，計(jì)算了在NIR照射下細(xì)胞的半數(shù)最大抑制濃度（IC50），得出了TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在單一PDT、單一PTT和PDT與PTT結(jié)合中的IC50值分別為16.8、5.6和5.0 µM（圖4d）。相比之下，在4T1細(xì)胞中，TCF-Cy7-TCF在單一PTT和PDT/PTT結(jié)合中的IC50值分別為29.6和25.4 µM。這些結(jié)果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟介導(dǎo)的PTT和PDT結(jié)合作為一種有前途的策略，可以在空間和時(shí)間可控的方式中，以高生物安全性有效消除癌細(xì)胞。
在牛血清白蛋白（BSA）溶液中使用TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的吸收和熒光光譜評(píng)估TCF-Cy7(Py)-TCF的非特異性結(jié)合，陰離子TCF-Cy7-TCF作為對(duì)照（圖5a，b）。在含有BSA的水溶液中，TCF-Cy7-TCF恢復(fù)了其在有機(jī)溶劑中的特征吸收，并在≈950 nm處顯示出強(qiáng)烈的熒光，表明TCF-Cy7-TCF通過與BSA結(jié)合從寡聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF在BSA溶液中的吸收和熒光光譜未顯示顯著變化，這表明它與BSA沒有顯著的相互作用。進(jìn)一步進(jìn)行分子對(duì)接研究，通過使用優(yōu)化構(gòu)象評(píng)估TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA的相互作用。TCF-Cy7-TCF與BSA的結(jié)合能為?9.86 kcal mol?1，而TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA的結(jié)合能僅為?5.81 kcal mol?1，表明由于其雙性離子和親水性性質(zhì)，TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA結(jié)合口袋的結(jié)合要比陰離子TCF-Cy7-TCF弱得多（圖5c）。
由TCF-Cy7（Py）-TCF納米微?；騎CF-Cy7-TCF的光熱轉(zhuǎn)換引起的熱彈性膨脹產(chǎn)生了光聲（PA）信號(hào)，該信號(hào)被用作非侵入性PA成像的造影劑。如圖5d，e所示，腫瘤部位TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的PA信號(hào)在1-8小時(shí)內(nèi)迅速增加，并且顯著高于腫瘤中TCF-Cy7-TCF的PA信號(hào)，這可能是由于TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的光-熱轉(zhuǎn)換較高。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，用TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒處理的小鼠的初始PA背景遠(yuǎn)低于TCF-Cy7-TCF，并且在24小時(shí)后幾乎可以忽略不計(jì)，這可能是由于快速清除和低非特異性攝取TCF-Cy7（Py）-TCF。相反，TCF-Cy7-TCF在同一時(shí)間過程中幾乎沒有背景降低，表明在正常組織和器官中有顯著的非特異性攝?。▓D5d）。
之后研究者測(cè)量了TCF-Cy7（Py）-TCF納米AUCER或TCF-Cy7-TCF在小鼠4T1腫瘤模型中的體內(nèi)性能。注射后8小時(shí)，小鼠接受剖腹手術(shù)，僅在腫瘤（信號(hào)背景比，SBR:2.57±0.56）和腸道（SBR:1.65±0.56）中觀察到NIR窗口I（NIR-I，700-900 nm）中TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的熒光，而TCF-Cy7-TCF主要在肝臟（SBR:2.47±0.10）和腸道（SBR:5.02±0.26）等代謝器官中表現(xiàn)出高NIR-I信號(hào)，證實(shí)TCF-Cy7（Py）-TCF納米微?？梢遭g化Ely通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位累積（圖5f）。值得注意的是，在含白蛋白的環(huán)境中，TCF-Cy7-TCF的熒光峰紅移至943 nm，而TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的最大發(fā)射保持在980 nm（圖5b），兩者均顯示第二個(gè)NIR窗口（NIR-II，1000-1700 nm）的尾部熒光，由于穿透深度更深，分辨率更高，自發(fā)熒光為零，可用于避免剖腹手術(shù)和開胸手術(shù)。注射后6-8小時(shí)，通過用NIR-II PL體內(nèi)成像系統(tǒng)（系列III 900/1700）繪制NIR-II熒光強(qiáng)度圖，TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的信號(hào)在腫瘤（SBR:7.95±0.11）和肝臟（SBR:6.08±1.56）中積累，對(duì)比度良好（圖5g）。為了比較，系統(tǒng)地觀察到TCF-Cy7-TCF的NIR-II信號(hào)，在沒有腫瘤靶向的正常組織和器官中顯示出顯著的非特異性攝取。剖腹手術(shù)后的影像學(xué)結(jié)果非常相似（圖5g）。總體而言，兩性離子TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒通過電荷/疏水性屏蔽最小化了與血清白蛋白的相互作用，并在腫瘤部位累積，減少了正常組織和器官中的非特異性攝取，從而產(chǎn)生足夠高的腫瘤背景比成像。
圖6. TCF-Cy7（Py）-TCF體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤光療。
在多模式成像的指導(dǎo)下，研究者使用TCF-Cy7-TCF作為對(duì)照，進(jìn)一步評(píng)估了TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒對(duì)攜帶4T1癌癥的皮下腫瘤異種移植小鼠的光療功效。將35只小鼠隨機(jī)分為7組，用紅外熱成像監(jiān)測(cè)腫瘤表面的實(shí)時(shí)溫度（圖6a）。照射后10分鐘內(nèi)，“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤表面溫度超過50°C，而“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.15 W cm-2”，“TCF-Cy7-TCF+0.5 W cm-2”和“鹽水+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤表面溫度僅分別增加至41、42和34°C（圖6b）。每組腫瘤大小每2天監(jiān)測(cè)一次，持續(xù)16天（圖6c，d）。對(duì)照組小鼠的腫瘤大小持續(xù)增加，與第1天相比，在第16天經(jīng)歷了約13倍的擴(kuò)張，這些組之間的腫瘤體積沒有顯著差異（圖6d）?！癟CF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤被有效消融，導(dǎo)致腫瘤部位出現(xiàn)燒傷疤痕，這在對(duì)照組中未觀察到（圖6c）。到第11天，用TCF-Cy7（Py）-TCF進(jìn)行協(xié)同光療的小鼠的瘢痕已經(jīng)愈合，并且在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)沒有觀察到腫瘤復(fù)發(fā)，直到anlesi之前也沒有任何死亡率。通過蘇木精和曙紅（H＆E）以及不同組腫瘤的TUNEL染色也證實(shí)了體內(nèi)腫瘤光療的效果。H＆E染色清楚地顯示“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組中的腫瘤具有大量壞死區(qū)域，TUNEL染色顯示細(xì)胞凋亡在腫瘤中有效的“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組（圖6e）。
總之，本文提出了“聚集體中的SOCT-ISC”的概念，以增強(qiáng)基于小分子的PS的PDT和PTT性能，旨在協(xié)同光療腫瘤?；谶@一概念，通過在陰離子TCF-Cy7-TCF的中間位置摻入陽離子Py基團(tuán)來設(shè)計(jì)小分子PS，從而形成正交的二元TCF-Cy7（Py）-TCF。這種二元自組裝成納米聚集體，與母體分子TCF-Cy7-TCF相比，ROS產(chǎn)生（0.8%）和光熱轉(zhuǎn)換效率（55.06%）顯著增強(qiáng)。值得注意的是，TCF-Cy7（Py）-TCF的兩性離子性質(zhì)賦予納米聚集體以優(yōu)異的穩(wěn)定性，即使在超低濃度下也是如此，并且賦予它們低的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致正常組織和器官中的攝取最小，并且腫瘤中的高積累用于多模式成像。最后，TCF-Cy7（Py）-TCF納米聚集體在體外和體內(nèi)均具有優(yōu)異的抗腫瘤功效，并具有高生物相容性。這種的超分子策略可能為設(shè)計(jì)用于抗腫瘤治療中協(xié)同PTT/PDT的高性能小分子PS提供有價(jià)值的見解，顯示出未來臨床實(shí)施的巨大潛力。
參考文獻(xiàn)
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