上新 | 中外法規(guī)藥典內毒素檢測新趨勢-重組C因子法

已知，凡是能造成生物機體體溫上升的物質均可稱為熱原（Pyrogen），其來源可能多樣化。而細菌內毒素（Endotoxin）是熱原的一種，它是細菌性感染的一個重要致病因素。

內毒素是革蘭氏陰性菌菌體中存在的毒性物質總稱，為多種革蘭氏陰性菌細胞壁上的teyou結構。細菌內毒素主要由磷脂、脂蛋白和脂多糖（LPS）組成，其中脂多糖（LPS）是天然或實驗室制備的內毒素復合物的生物活性部分，發(fā)揮毒性作用的是類脂質A（Lipid A）。不同革蘭氏陰性菌的脂質A結構基本相似，所以由此類細菌引起的感染導致的毒性效應大致相同，主要表現為發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等。細菌在存活狀態(tài)時不會釋放內毒素，但當細菌死亡裂解或者自溶后，內毒素會被大量釋放出來。

圖1.革蘭氏陰性菌結構圖

細菌內毒素耐熱性和化學穩(wěn)定性很強，一般的方法很難將其去除或滅活，如：常規(guī)高壓滅菌法也不能將內毒素chedi清除，一般的化學藥品也不會影響細菌內毒素的活性，只有強酸、強堿或強氧化劑可以破壞其結構。但內毒素具有水溶性，生產中可用無熱原水沖洗以除去熱原；其還具有被吸附性，可用活性碳將其吸附。

細菌內毒素是目前最危險和最常見的致熱污染物之一，主要原因為：它在自然界中無處不在（革蘭氏陰性菌即使在干凈的水中也能繁殖）、毒性強、在jiduan條件下也很穩(wěn)定、生產過程中很容易引入。對于日常的生命科學實驗，使用細菌制備的質粒DNA和重組蛋白中都會有內毒素的殘留，而且很難去除干凈，進而對后續(xù)實驗帶來潛在毒性影響。內毒素的主要成分脂多糖有強烈的免疫活性和細胞毒性并產生復雜的細胞生物學效應，因此大多數情況下會明顯干擾并產生不可預測的實驗結果。對生物系統，當人（或動物）體血液系統的輸入液中混入微量的細菌內毒素時，可激活組織內的炎性細胞和炎癥因子，導致機體發(fā)熱并產生全身性炎癥反應，在很短時間內將會使人產生昏迷和高燒，若不及時搶救，很可能危及生命。

因此，無論是用于生命科學研究的可能含有內毒素的相關試劑，還是用于人和動物預防或治療的化學藥品、抗生素、生物制品等的原輔料、中間品和放行產品均需要進行內毒素檢測，以確保有效性和安全性。

從20世紀開始，內毒素檢測方法相繼出現。

鑒于上述情況，國內外藥典法規(guī)也提出了一些新的內毒素檢測方法。如：2020版《中國藥典》（四部）9251章節(jié)中提到可以采用重組C因子法檢測細菌內毒素（C因子是鱟試劑中對細菌內毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內毒素）。美國藥典(USP)專家委員會也已于2024年7月26日批準將USP<86>Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents納入《美國藥典-國家處方集》，USP<86>章節(jié)于2024年11月發(fā)布，并于2025年5月正式生效。重組C因子法(rFc)通過重組方法產生C因子，具有：C因子來源穩(wěn)定，受批次影響?。徊僮骱唵慰焖?；更強的抗干擾能力（不受β-glucans影響）；專屬性好等優(yōu)點。該方法也有其缺點，主要為來源于不同品質鱟血蛋白序列的重組蛋白對內毒素的反應性可能不同。

圖2.中外法規(guī)里列舉的內毒素檢測方法

2020版《中國藥典》（三部）針對細菌內毒素檢測，收錄了包括凝膠法和光度法在內的共6種細菌內毒素檢查方法。

凝膠法和光度法等都需要從海洋節(jié)肢動物鱟中取鱟血作為原料，而鱟目前已呈瀕?，F狀，亟需尋求替代方法。2020版《中國藥典》（四部）9251章節(jié)中提到可以采用重組C因子法檢測細菌內毒素。此外，美國、歐洲和日本藥典也都提到可以采用重組C因子法檢測細菌內毒素。

表1.各種內毒素檢測方法介紹

目前，行業(yè)內對于內毒素的檢測，雖然仍以鱟試劑方法為主，但也逐漸接受重組C因子的檢測方法。為此，翌圣生物自主研發(fā)了重組C因子內毒素檢測試劑盒。

本試劑盒通過基因重組的方式表達C因子，然后重組C因子被待測樣本中的細菌內毒素激活，進而酶切水解熒光底物，產生與內毒素濃度成比例的熒光信號，根據熒光信號值檢測內毒素含量。本試劑盒可以用于人類疾病治療的注射藥物（如化學藥品、抗生素、生物制品等）和醫(yī)療器械（包括透析液、植入式器械等）的原輔料、研發(fā)和生產工藝過程以及商業(yè)化進程中的內毒素檢測。

試劑盒檢測范圍為0.005~5EU/mL，R2=0.9968，各濃度檢測值CV≤10%。

圖3.重組C因子內毒素檢測試劑盒標準曲線

該重組C因子內毒素檢測試劑盒不受鱟試劑中β葡聚糖的干擾，避免了因β-葡聚糖引起的假陽性/結果不準確情況。

表2.不同內毒素檢測方法數據對比