Piezo1 通道通過介導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的鐵內(nèi)流來加劇髓核細(xì)胞的鐵死亡

Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx

Subject terms: Homeostasis, Pathogenesis

機(jī)械應(yīng)力可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞活動，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化和自噬。鈣離子（Ca2+）通過機(jī)械敏感的 Piezo1 通道對機(jī)械刺激做出反應(yīng)。Piezo1可以檢測機(jī)械應(yīng)力，如靜壓、剪切應(yīng)力和膜拉伸。此外，Piezo1 也是一種機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，用于 Ca2+ 介導(dǎo)的髓核細(xì)胞（NPCs）中硬化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的激活。

椎間盤（IVD）是一個生理負(fù)壓器官。除了維持人體髓核（NP）組織的生理功能外，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械應(yīng)力在內(nèi)部微環(huán)境中也起著重要作用。力學(xué)性能的變化與 IVD 結(jié)構(gòu)和組成的異常變化之間存在正相關(guān)。此外，Piezo1 在退化的 NP 樣本中上調(diào)，機(jī)械應(yīng)力激活的 Piezo1 可以通過骨膜素（periostin）和 NF-kB 的自我放大循環(huán)加速人類 NPCs 的衰老和椎間盤退變的進(jìn)展。

鐵（Fe）是人體必需的元素。然而，病理性鐵積累可導(dǎo)致氧化性細(xì)胞損傷和鐵死亡，這是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化、活性氧大量累積所致的細(xì)胞死亡模式。鐵死亡需要鐵，Piezo1 通道是機(jī)械敏感的離子通道。但是迄今為止，可用于鐵內(nèi)流的分子很少。

鑒于此，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨科、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院及天津醫(yī)院脊柱外科的聯(lián)合團(tuán)隊在一項(xiàng)研究中旨在闡明 Piezo1 通道在 IVD 和 NPCs 鐵死亡中的作用，結(jié)果表明，Piezo1 是鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，直接促進(jìn)鐵內(nèi)流、調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)生物標(biāo)志物和影響 GPX4 的表達(dá)（鐵死亡中的主要成分）。研究成果發(fā)表在 Bone Research  期刊題為“Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx”。

首先，為了研究機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的 NPCs 變化，將原代大鼠 NPCs 分離并在無 Ca2+ 的培養(yǎng)基中施加1 MPa 的機(jī)械壓縮力。結(jié)果顯示，Piezo1 在機(jī)械應(yīng)力下上調(diào)。此外，Piezo1 表達(dá)與鐵代謝基因（包括 ACSL4 和 DMT1）的表達(dá)呈正相關(guān)，與 GPX4 和 FSP1 呈負(fù)相關(guān)。GO 和 KEGG 富集分析表明，機(jī)械應(yīng)力影響鐵死亡相關(guān)通路。1 MPa  的機(jī)械應(yīng)力 以時間依賴性方式顯著改變了細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 以及鐵代謝和鐵死亡蛋白水平。

進(jìn)一步利用Piezo1抑制劑GsMTx4 或鐵死亡抑制劑（Fer-1）處理，發(fā)現(xiàn)GsMTx4 減輕了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的損傷，通過阻斷 Piezo1 減少了鐵積累，表明 Piezo1 參與了 NPCs 的鐵過載。此外，1 MPa 刺激顯著促進(jìn)了 NPCs 的細(xì)胞死亡，而GsMTx4 和 Fer-1 減輕了這種影響。通過收集NP樣本確定 IVD 退變是否涉及鐵過載，發(fā)現(xiàn)退行性 NP 組織中的鐵水平增加。免疫組化結(jié)果顯示，Piezo1 和鐵死亡相關(guān)基因 ACSL4 在高度退變患者中上調(diào)，而 GPX4 下調(diào)，這與機(jī)械應(yīng)力刺激的結(jié)果一致。

然后測量 ROS 的水平。結(jié)果表明，機(jī)械應(yīng)力提高了 ROS 的生成，而 GsMTx4 處理減少了 ROS 的產(chǎn)生（圖1 a）。TEM顯示，機(jī)械應(yīng)力影響了線粒體結(jié)構(gòu)，線粒體收縮且嵴雜亂，而抑制Piezo1 減輕了這種影響（圖1 b）。測定線粒體的功能和生物標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)力會干擾，而抑制 Piezo1 則在無 Ca2+ 的環(huán)境中維持了線粒體的功能（圖1 c-e、i）。

據(jù)報道，Piezo1 在多種情況下促進(jìn)鐵死亡。因此，評估了 Piezo1 激活在 NPCs 鐵死亡改變中的作用。RT-PCR和 WB分析顯示，1 MPa 刺激改變了鐵代謝標(biāo)志物（TFRC、DMT1、FPN、FTH1、Hepcidin）和鐵死亡標(biāo)志物（NRF2、GPX4 、FSP1、ACSL4 ）的表達(dá)。然而，GsMTx4 減弱了機(jī)械應(yīng)力對鐵代謝相關(guān)基因、鐵死亡基因和蛋白質(zhì)的影響（圖1 f、g），而Fer-1 僅恢復(fù)鐵死亡標(biāo)志物的表達(dá)，這說明，Fer-1 不能有效阻止機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的鐵代謝變化（圖1 h）。此外，在 1 MPa 機(jī)械應(yīng)力下，陽性鐵死亡標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFRC）表達(dá)降低，脂質(zhì) ROS 水平顯著增加且被 GsMTx4 抑制（圖1 j-l）。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械應(yīng)力通過激活 Piezo1 影響鐵死亡。

圖1    機(jī)械應(yīng)力通過 Piezo1 激活影響鐵死亡。

接下來，研究了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的 NPCs 變化，在不含 Ca2+ 的培養(yǎng)基中用 Yoda1（Piezo1 的激動劑）培養(yǎng)細(xì)胞（圖2 a）。結(jié)果表明 Yoda1 改變了與鐵代謝和鐵死亡相關(guān)的基因水平（圖2 b-d）。GO、KEEG 和 GESA 分析還表明，Piezo1 激活影響鐵穩(wěn)態(tài)，表明藥物或機(jī)械應(yīng)力引起的 NPCs 中鐵代謝和鐵死亡的變化是相似的（圖2 e-g）。

因此，評估了 Piezo1 是否直接或間接影響鐵內(nèi)流。利用檸檬酸鐵銨（FAC）構(gòu)建細(xì)胞外鐵過載環(huán)境，用 Yoda1 或 GsMTx4 處理大鼠 NPCs（圖2 h、i）。結(jié)果顯示，Piezo1 的化學(xué)激活顯著破壞了細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接（圖2 j）。此外，FAC 增加了細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 和丙二醛（MDA）水平，尤其是在 Yoda1 存在的情況下，而GsMTx4 阻止了 Fe2+ 的大量內(nèi)流。這種趨勢在某種程度上獨(dú)立于 Ca2+，因?yàn)樵诓缓?Ca2+ 的培養(yǎng)基中也檢測到鐵的積累（圖2 k-m）。活/死測定顯示，Yoda1 顯著促進(jìn) NPCs 細(xì)胞死亡，GsMTx4 顯著減輕了這一現(xiàn)象（圖2 n）。CCK-8 結(jié)果還顯示，鐵環(huán)境破壞了細(xì)胞活力，而 Yoda1 以時間依賴性方式大大加速了細(xì)胞死亡（圖2 o）。上述結(jié)果表明，Piezo1 通道的藥理學(xué)激活顯著增加鐵過載。

進(jìn)一步將大鼠原代 NPCs 暴露于高鐵環(huán)境中，并用 Yoda1 或 GsMTx4 處理，評估 ROS 產(chǎn)生、脂質(zhì) ROS、線粒體結(jié)構(gòu)、功能和生物標(biāo)志物。TEM 分析顯示，Piezo1 激活影響線粒體結(jié)構(gòu)，而Piezo1 的抑制劑減輕了鐵刺激的有害影響。DCFDA 測定顯示，Yoda1 提高，而 GsMTx4 減少了 ROS 的產(chǎn)生。此外，Yoda1 導(dǎo)致 NPCs 功能紊亂，而 Piezo1 的抑制在高鐵環(huán)境中大大改善了這些影響。值得注意的是，TFRC 在高鐵環(huán)境中上調(diào)，而 GsMTx4 略微降低表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，Piezo1 通道激活后脂質(zhì) ROS 水平顯著增加。由于 GsMTx4 是 Piezo1 的非特異性激動劑，因此在 GsMTx4 存在下用 Yoda1 和 FAC 處理細(xì)胞，WB 和熒光染色圖像顯示，在 Yoda1 和 FAC 存在下，用 GsMTx4 或 si-Piezo1 阻斷 Piezo1 通道減弱了 Yoda1 的作用。這些結(jié)果表明，Piezo1 通道介導(dǎo)的鐵過載導(dǎo)致線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，其激活在鐵死亡發(fā)生中起重要作用。

圖2    Piezo1 通道的藥理學(xué)激活顯著增加了鐵過載。

TFRC 參與細(xì)胞內(nèi)鐵元素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，是鐵內(nèi)流因素。使用 Tfrc-siRNA 轉(zhuǎn)染敲低 Tfrc（KD）以研究 Piezo1 是否可以獨(dú)立于 TFRC 直接促進(jìn)鐵內(nèi)流。令人驚訝的是，Tfrc KD 并沒有保護(hù)受機(jī)械應(yīng)力處理的細(xì)胞的正常形態(tài)。Tfrc KD 并沒有緩解壓縮應(yīng)力誘導(dǎo)的 Fe2+ 內(nèi)流、MDA 和 ROS 增加以及線粒體功能障礙。此外，鐵代謝相關(guān)標(biāo)志物和鐵死亡標(biāo)志物的改變并未得到緩解。

有趣的是，轉(zhuǎn)染后在高鐵環(huán)境中用化學(xué)藥物刺激NPCs 時，其對 FAC 刺激變得不敏感，細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 和 MDA 水平降低證明了這一點(diǎn)。Tfrc KD 逆轉(zhuǎn)了 FAC 刺激的 Fe2+ 內(nèi)流、ROS 增加、線粒體膜電位和線粒體功能障礙，且在蛋白質(zhì)水平上減輕了 FAC 造成的損傷。然而，在高鐵環(huán)境中使用 Yoda1 處理后，這些表型沒有改變。盡管如此，即使在 Tfrc-siRNA 轉(zhuǎn)染后，Yoda1 和機(jī)械應(yīng)力組仍然表現(xiàn)出相同的鐵代謝相關(guān)標(biāo)志物和鐵死亡標(biāo)志物變化。值得注意的是，Yoda1 處理在正?；驘o鈣培養(yǎng)基中顯著誘導(dǎo)鐵過載，表明 Fe2+ 可以通過 Piezo1 通道轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明，Piezo1 誘導(dǎo)的鐵內(nèi)流與 TFRC 無關(guān)。

最后，為了評估 Piezo1 通道的基因阻斷是否減弱體內(nèi)的 IVDD 過程，建立了針刺小鼠模型（圖 3 a）。研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1 可干擾 GPX4 表達(dá)和鐵死亡，表明 Piezo1 可能通過 GPX4 調(diào)控 IVDD。因此，使用 WT、Gpx4-cKO、Piezo1-cKO 和 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠建立針刺尾骨 IVDD 模型以供進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，Piezo1 缺失減弱了 IVDD 的發(fā)展，而 Gpx4 的缺失顯著促進(jìn)了 IVDD 的發(fā)展。然而，IVDD 在 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中比在 Piezo1-cKO 小鼠中更嚴(yán)重。Micro-CT 顯示，Gpx4-cKO 小鼠退變嚴(yán)重。然而，敲除 Piezo1 可減輕 IVDD（圖3 b、c）。

此外，番紅素O 染色顯示，Piezo1 缺失顯著保留了組織學(xué)完整性和 ECM（圖3 d），以及代謝生物標(biāo)志物的表達(dá)。然而，Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中 Gpx4 的額外缺失消除了在 Piezo1-cKO 小鼠中檢測到的 IVDD 的緩解（圖3 e）。此外，免疫熒光染色檢測鐵代謝和鐵死亡指標(biāo)（ACSL4、DMT1、FSP1）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)保護(hù)性標(biāo)志物 FSP1 的熒光強(qiáng)度在 Piezo1-cKO 小鼠中增強(qiáng)，而在 Gpx4-cKO 和 Gpx4/Piezo1-cKO 小鼠中降低。相比之下，ACSL4 和 DMT1 的熒光強(qiáng)度顯示出相反的趨勢（圖3 f-i）。qPCR 結(jié)果顯示，Gpx4 在 Piezo1 敲低細(xì)胞和 Piezo1-CKO 小鼠中增加，但 Gpx4-CKO 和 WT 小鼠之間的 Piezo1 表達(dá)水平無顯著差異。這些結(jié)果表明，Piezo1 可以通過影響 GPX4 來調(diào)控 IVDD 進(jìn)展（圖4）。

圖3    Piezo1 通道的缺失通過 GPX4 減弱了 IVDD 的發(fā)展。

圖4    鐵代謝模式示意圖。（a）正常條件下細(xì)胞的鐵代謝模式。

（b）機(jī)械應(yīng)力下細(xì)胞的鐵代謝模式

綜上所述，該研究表明，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的 Piezo1 激活在鐵代謝和鐵死亡的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。這一結(jié)論基于三個主要發(fā)現(xiàn)。首先，Piezo1 通道的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵過載，最終以應(yīng)力反應(yīng)方式導(dǎo)致鐵死亡。其次，Piezo1 通道的激活以不依賴 TFRC 的方式直接介導(dǎo)鐵內(nèi)流，這可能發(fā)生在早期階段，伴隨著 TFRC 的反饋下調(diào)。第三，Piezo1 或其抑制劑 GsMTx4 的缺失可以逆轉(zhuǎn)鐵過載，Piezo1-鐵-鐵死亡軸可能是機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)疾病的一種新型治療方法。

參考文獻(xiàn)：Xiang Z, Zhang P, Jia C, Xu R, Cao D, Xu Z, Lu T, Liu J, Wang X, Qiu C, Fu W, Li W, Cheng L, Yang Q, Feng S, Wang L, Zhao Y, Liu X. Piezo1 channel exaggerates ferroptosis of nucleus pulposus cells by mediating mechanical stress-induced iron influx. Bone Res. 2024 Mar 29;12(1):20. doi: 10.1038/s41413-024-00317-9. PMID: 38553442; PMCID: PMC10980708.

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