實時熒光定量PCR系統(tǒng)的原理定義

來源：北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司 2025年02月10日 16:14

實時熒光定量PCR（Real-TimePCR，簡稱qPCR）是一種基于聚合酶鏈式反應（PCR）的高靈敏度、高特異性的分子生物學技術(shù)，用于定量分析DNA或RNA的含量。它通過實時監(jiān)測PCR反應過程中產(chǎn)生的熒光信號的變化來實現(xiàn)對靶標核酸的定量分析。

原理定義：

實時熒光定量PCR系統(tǒng)的原理基于PCR反應的擴增過程，在此過程中利用熒光染料或熒光探針對PCR產(chǎn)物進行實時檢測和定量。

PCR擴增過程：

通過PCR擴增反應，DNA模板經(jīng)過多個循環(huán)逐步擴增，生成大量的目標DNA片段。

在每一個循環(huán)中，模板DNA會被熱變性（使雙鏈DNA分開）、退火（引物與模板配對）和延伸（DNA聚合酶合成新鏈）等步驟逐漸擴增。

熒光信號的產(chǎn)生：

在擴增過程中，熒光染料或探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。實時PCR系統(tǒng)通過監(jiān)測這些熒光信號的變化來判斷目標核酸的數(shù)量。

常用的熒光探針和染料包括：

SYBRGreen：與雙鏈DNA結(jié)合時發(fā)出熒光，適用于檢測PCR產(chǎn)物。

TaqMan探針：是一種帶有熒光基團和猝滅基團的探針，只有當探針與目標DNA結(jié)合并在PCR反應過程中被DNA聚合酶切割時，才會釋放熒光信號。

MeltCurve分析：通過熔解曲線分析，可以進一步確認PCR產(chǎn)物的特異性。

實時檢測和定量：

在每一輪PCR擴增的過程中，實時熒光定量PCR系統(tǒng)都會在每一個擴增周期結(jié)束時，檢測熒光信號的強度。

熒光信號的強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此可以通過熒光信號的變化曲線來推算目標核酸的初始濃度。

在PCR反應的指數(shù)擴增階段，熒光信號與目標DNA的量呈指數(shù)關(guān)系，系統(tǒng)可以通過分析信號的上升曲線（Ct值，臨界閾值）來定量目標DNA或RNA的濃度。

定量分析：

Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）：是指PCR反應中，熒光信號達到預設的閾值時的循環(huán)數(shù)。Ct值與樣本中的初始靶標DNA/RNA濃度成反比，Ct值越小，表示初始模板的濃度越高。

標準曲線法：使用已知濃度的標準品構(gòu)建標準曲線，根據(jù)樣本的Ct值對其進行定量。

相對定量：可以通過對照基因或內(nèi)參基因的表達量與目標基因的表達量進行比對，得出目標基因的相對表達量。

優(yōu)點：

高靈敏度與高特異性：通過實時監(jiān)測熒光信號，可以在PCR擴增的初期階段檢測到目標核酸，具有很高的靈敏度和特異性。

定量精準：實時監(jiān)測每一個PCR循環(huán)中的熒光信號，可以精確地定量目標核酸的初始含量。

無需后期電泳：與傳統(tǒng)的PCR方法不同，實時熒光定量PCR不需要使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了操作時間和誤差。

應用：

基因表達分析：用于檢測基因的相對或絕對表達量。

病原檢測：如病毒、細菌等的定量檢測。

基因突變分析：檢測特定基因的突變。

定量檢測DNA、RNA：適用于定量DNA或RNA模板，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化等。

實時熒光定量PCR為分子生物學研究和臨床應用提供了強大的工具，尤其是在基因表達、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。

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