人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞外基質(zhì)重塑

Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia

Keywords: extracellular matrix; human umbilical cord mesenchymal stem cells; microglia; migration; neuroinflammation.

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，是大腦發(fā)育、體內(nèi)平衡和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵參與者。小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性，并可根據(jù)位置和系統(tǒng)需求獲得各種結(jié)構(gòu)變化和轉(zhuǎn)錄表型。在可以驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞走向有益表型的策略中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是目前正在被研究作為影響成人和新生兒神經(jīng)炎癥性疾病的有吸引力的細(xì)胞療法。MSCs調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞效應(yīng)功能并減弱活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床前模型中腦組織功能的恢復(fù)，包括圍產(chǎn)期腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病。

具體來說，在TBI小鼠模型中，MSCs的分泌蛋白組在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)促再生小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（Ym1和Arg1 mRNAs）的表達(dá)，促進(jìn)其持續(xù)恢復(fù)。此外，當(dāng)與MSCs共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)炎性細(xì)胞因子有反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放細(xì)胞外囊泡（EVs），當(dāng)注射到脫髓鞘小鼠模型中時(shí)，這些EVs會(huì)促進(jìn)髓鞘病變部位的髓鞘修復(fù)。然而，MSCs 促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向穩(wěn)態(tài)/促再生功能轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制仍有待闡明。

最近，在意大利國家研究委員會(huì)神經(jīng)科學(xué)研究所、米蘭比可卡大學(xué)醫(yī)學(xué)與外科系及英國諾丁漢特倫特大學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，通過使用大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，揭示了與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（h-MSCs）共培養(yǎng)誘導(dǎo)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)通路，闡釋了細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑；還研究了 h-MSCs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞在體外響應(yīng)細(xì)胞因子的基本功能的影響，包括增殖、運(yùn)動(dòng)、吞噬作用和抗原呈遞。研究成果發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia”

為了表征 h-MSCs 對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞（TNFα+ IFNγ+ IL-1β 刺激）的影響，首先通過 qPCR 量化了保護(hù)/免疫調(diào)節(jié)基因（Arg1 和 Socs3 mRNAs）、炎癥基因 （Tnfα 、 Ptgs2、Nos2、Il1β 和 Il6 mRNAs）、穩(wěn)態(tài)基因 Tmem119 和疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞（DAM）基因 Clec7a mRNA 的表達(dá)。結(jié)果表明，在炎癥條件下，單獨(dú)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)了炎癥基因Tnfα、Ptgs2、Nos2、Il6 mRNAs，免疫調(diào)節(jié)基因 Socs3 和激活標(biāo)志物 Clec7a，而與 h-MSCs 共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)了 Arg1、Socs3 及Tmem119 mRNA 表達(dá)，并下調(diào)了 Clec7a mRNA。h-MSCs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥基因表達(dá)的影響很復(fù)雜，一些炎癥基因下調(diào)，如Tnfα 和 Ptgs2，而其他，如Nos2、Il6 和 Il1β 呈現(xiàn)過表達(dá)（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，盡管h-MSCs 維持甚至上調(diào)了一些炎癥特征，但在細(xì)胞因子的作用下，h-MSCs 誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞中保護(hù)性標(biāo)志物的表達(dá)并部分抵消了炎癥基因表達(dá)。

為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，在體外小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中量化了免疫調(diào)節(jié)標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物和抗炎標(biāo)志物的表達(dá)。數(shù)據(jù)表明，與從混合培養(yǎng)物中獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，h-MSCs 在體外小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎癥細(xì)胞因子的反應(yīng)中更快、更有效地抑制炎癥基因表達(dá)，這與在大腦環(huán)境中缺乏抑制信號(hào)的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞在體外存活時(shí)間更長的反應(yīng)性是一致的。

圖1     h-MSCs 影響原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)和活化標(biāo)志物表達(dá)。

為了更深入地了解 h-MSCs 與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，接下來進(jìn)行了大量 RNA-seq。在存在或不存在 h-MSCs 的情況下培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)分析顯示，共有 1519 個(gè)顯著失調(diào)的 mRNAs （711 個(gè)上調(diào)和 808 個(gè)下調(diào)）。在被 h-MSCs 高度上調(diào)的基因中，發(fā)現(xiàn)了保護(hù)/免疫調(diào)節(jié)基因 Arg1 和 Socs3，以及 Il1β 和血清淀粉樣蛋白Saa3，這證實(shí)了上述通過 qPCR 分析觀察到的結(jié)果。此外，還檢測到編碼ECM成分的蛋白及其調(diào)節(jié)因子的顯著上調(diào)。相反，穩(wěn)態(tài)基因 Cx3cr1 和脂蛋白脂酶（Lpl）mRNA 是下調(diào)最多的基因，這一發(fā)現(xiàn)與顯示這些標(biāo)記物在小膠質(zhì)細(xì)胞激活時(shí)下調(diào)的研究數(shù)據(jù)一致。

對(duì)DEGs通路的進(jìn)一步分析強(qiáng)調(diào)了小膠質(zhì)細(xì)胞在積極修飾 ECM 和影響 ECM 依賴性神經(jīng)元活動(dòng)（如軸突導(dǎo)向）中的關(guān)鍵作用，表明 h-MSCs 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞可能參與 ECM 重塑和沉積?；蚣患治觯?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">GSEA）顯示，與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，在 h-MSCs 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中有10個(gè)基因組富集，表明 h-MSCs 顯著改變了 ECM 基因表達(dá)。這些數(shù)據(jù)有力地支持了由小膠質(zhì)細(xì)胞引起的 ECM 變化受 h-MSCs 直接調(diào)控的觀點(diǎn)。

其中，較豐富的基因集是 NABA_CORE_MATRISOME，這是編碼核心細(xì)胞外基質(zhì)元件的基因集合，分析顯示，其存在編碼幾種關(guān)鍵 ECM 成分的基因的存在，例如膠原蛋白亞型、層粘連蛋白1-2-4、玻連蛋白等。其他上調(diào)的 NABA 基因包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 （Tgm1-2-4-6-7），它們通過細(xì)胞外交聯(lián)活性在ECM穩(wěn)定和抗降解中發(fā)揮重要作用?？偟膩碚f，觀察到的 NABA 基因上調(diào)表明 ECM 沉積和穩(wěn)定增加。

通路分析和 GSEA 還揭示了與單獨(dú)培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞相比，h-MSCs 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4 和 -13 以及白細(xì)胞介素-10 的富集信號(hào)（圖2 A、B）。此外，使用免疫過程負(fù)調(diào)控特異性基因集的進(jìn)一步 GSEA 證實(shí)了參與免疫調(diào)節(jié)途徑的基因的富集（圖2 B），這與 h-MSCs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的復(fù)雜作用一致（圖1）。對(duì)關(guān)鍵小膠質(zhì)細(xì)胞功能特異性基因集的 GSEA 證實(shí)了控制細(xì)胞周期的基因下調(diào)（圖2 C），抗原呈遞相關(guān)基因的下調(diào)（圖2 C），但參與吞噬作用的基因表達(dá)無變化。相反，與單獨(dú)培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞相比，hMSCs 處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中與黏著斑、趨化因子活性、髓樣細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因顯著富集（圖2 C），表明 h-MSCs 處理提高了小膠質(zhì)細(xì)胞在環(huán)境中的監(jiān)測能力。

這些數(shù)據(jù)表明，增殖、抗原呈遞和運(yùn)動(dòng)/遷移是受 h-MSCs 影響的關(guān)鍵小膠質(zhì)細(xì)胞功能，此外還有 ECM 重塑和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

圖2     RNA-seq 分析顯示與 h-MSCs 共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

最后，為了探索 h-MSCs 誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化如何影響小膠質(zhì)細(xì)胞功能，分析單獨(dú)培養(yǎng)或與 h-MSCs 一起培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞中ECM 沉積、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖、吞噬作用和抗原呈遞能力。

免疫熒光分析顯示，與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，h-MSCs處理的小膠質(zhì)細(xì)胞及其周圍環(huán)境的ECM成分纖維連接蛋白染色增加（圖3 A、B），細(xì)胞外交聯(lián)劑 TG2 的免疫反應(yīng)性也更強(qiáng)（圖3 C、D），這表明暴露于 h-MSCs 的活化小膠質(zhì)細(xì)胞中，TG2 酶活性和 ECM 重塑/穩(wěn)定增加。

然后監(jiān)測小膠質(zhì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，分析顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，與 h-MSCs 培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的移動(dòng)路徑更長，速度更快，并且細(xì)胞褶皺形成增加（圖3 E、F），這是積極遷移細(xì)胞的特征。增殖測定發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中 EdU+ 增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞的百分比強(qiáng)烈降低，這與之前的研究一致，表明炎癥刺激 LPS 強(qiáng)烈抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，但 h-MSCs 培養(yǎng)并沒有進(jìn)一步降低，排除了 h-MSCs 對(duì)該細(xì)胞功能的主要影響。對(duì)吞噬的定量分析表明，單獨(dú)培養(yǎng)或與 h-MSCs 共培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力與對(duì)照細(xì)胞的吞噬能力沒有差異。

此外，還評(píng)估了主要組織相容性復(fù)合物II（MHCII）蛋白（小膠質(zhì)細(xì)胞抗原呈遞能力的指標(biāo)）和CLEC7a（活化反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（ARMs）標(biāo)志物）的表達(dá)。結(jié)果表明，與單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照小膠質(zhì)細(xì)胞相比，對(duì)炎性細(xì)胞因子有反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的 MHCII 和 CLEC7a 免疫反應(yīng)性增加，表明抗原呈遞能力和細(xì)胞活化增強(qiáng)。然而，在與 h-MSCs 共培養(yǎng)的活化小膠質(zhì)細(xì)胞中，MHCII 水平恢復(fù)到對(duì)照水平，CLEC7a 表達(dá)甚至低于對(duì)照水平，揭示了 MSCs 分泌蛋白組抑制免疫小膠質(zhì)細(xì)胞功能的能力。

這些數(shù)據(jù)表明，h-MSCs 在炎癥刺激下促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中的 ECM 沉積和運(yùn)動(dòng)，但不會(huì)顯著影響這些細(xì)胞的增殖和吞噬能力。此外，h-MSCs 可抵消炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 MHCII 和 CLEC7a 蛋白水平的增加。

圖3   h-MSCs 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)組成和小膠質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響。

圖4    在這項(xiàng)研究中，利用 h-MSCs 對(duì)非接觸培養(yǎng)物中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以確定受 h-MSCs 影響的分子途徑并探索它們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響，發(fā)現(xiàn) h-MSCs 分泌組改變的相關(guān)途徑與 ECM 重塑有關(guān)，導(dǎo)致 ECM 沉積增加和小膠質(zhì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加。

總之，該研究通過體外共培養(yǎng)方法結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能分析，揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞中 ECM 重塑和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是受 h-MSCs 分泌組控制的新功能?？刂?ECM 重塑的轉(zhuǎn)錄變化可能是促再生小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，這有助于在神經(jīng)炎癥性疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮 h-MSCs 的保護(hù)作用，這一假設(shè)仍有待在未來的研究中探索。

參考文獻(xiàn)：Lombardo MT, Gabrielli M, Julien-Marsollier F, Faivre V, Le Charpentier T, Bokobza C, D'Aliberti D, Pelizzi N, Halimi C, Spinelli S, Van Steenwinckel J, Verderio EAM, Gressens P, Piazza R, Verderio C. Human Umbilical Cord-Mesenchymal Stem Cells Promote Extracellular Matrix Remodeling in Microglia. Cells. 2024 Oct 9;13(19):1665. doi: 10.3390/cells13191665. PMID: 39404427; PMCID: PMC11475221.

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