高度穩(wěn)定的NIR-II發(fā)光雙自由基類化合物用于癌癥光療診斷

本文要點(diǎn)：NIR-II光療劑已成為癌癥早期診斷和精確治療的重要藥物。具有特殊結(jié)構(gòu)和窄帶隙的有機(jī)開殼二自由基類化合物因其強(qiáng)烈的自旋耦合效應(yīng)和近紅外光捕獲能力而成為光療劑的有前景的候選者。然而，考慮到其高化學(xué)反應(yīng)性和自吸收性，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定有效的NIR-II發(fā)光二自由基類化合物至關(guān)重要，但也頗具挑戰(zhàn)性。在此，通過采用受主平面化/π共軛擴(kuò)展和施主旋轉(zhuǎn)策略，成功制備了兩種高度穩(wěn)定的NIR-II發(fā)光二自由基化合物2PhNVDPP和PhNVDPP。在包封到水分散性納米粒子（NPs）中后，2PhNVDPP NPs表現(xiàn)出NIR-II發(fā)光、53%的高PCE和改進(jìn)的光/熱穩(wěn)定性。2PhNVDPP NPs的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了血管和腫瘤的清晰可視化，以及成功的NIR-II成像引導(dǎo)的腫瘤光熱消融。這項(xiàng)研究不僅開發(fā)了一種具有NIR-II發(fā)光的開創(chuàng)性穩(wěn)定的二自由基類光療劑，還為多模式抗癌治療的有效性提供了特殊視角。

活體成像

在此，通過采用包括受體平面化、π-共軛擴(kuò)展和供體旋轉(zhuǎn)策略的協(xié)同方法，構(gòu)建了NIR-II FLI引導(dǎo)的癌癥PTT的高度穩(wěn)定的二己二酸。設(shè)計(jì)并合成了兩種化合物，即2PhNVDPP和PhNVDPP，它們都具有相同的共面受體，但扭曲的供體結(jié)構(gòu)不同。變溫電子自旋共振（VT-ESR）和密度泛函理論（DFT）表明，這兩種化合物具有開殼二自由基特性。正如預(yù)期的那樣，這兩種二羥基化合物都顯示出NIR-II熒光發(fā)射，其特征是尾部發(fā)射達(dá)到1300 nm區(qū)域。在將兩種共軛二自由基組裝成水溶性納米粒子（NPs）以提高其生物相容性和生物穩(wěn)定性后，2PhNVDPP NPs在808 nm下表現(xiàn)出較好的光捕獲能力（1.8×104 M–1 cm–1），理想的NIR-II發(fā)光（1013 nm），53%的高PCE和優(yōu)異的光/熱穩(wěn)定性。同時，2PhNVDPP NPs顯示出非凡的實(shí)時血管系統(tǒng)和腫瘤成像能力。2PhNVDPP NPs在腫瘤中的明顯積累促進(jìn)了它們在4T1荷瘤小鼠模型中用于NIR-II FLI引導(dǎo)的PTT抗癌治療。這項(xiàng)工作為開發(fā)高度穩(wěn)定的NIR-II發(fā)光雙自由基材料，提高癌癥診斷和治療研究的準(zhǔn)確性提供了有前景的指導(dǎo)。

圖1. 合成路線和表征

如圖1a所示，精心合成了兩個分子，即2PhNVDPP和PhNVDPP。為了驗(yàn)證二自由基特征，在d4-1,2-二氯乙烷（C2D4Cl2）中對2PhNVDPP進(jìn)行了VT 1H NMR測量。隨著溫度從323 K降低到243 K，與芳香環(huán)和共軛二烯相關(guān)的質(zhì)子峰（δ=8.49、7.19-7.15、6.68、6.59、6.37和5.39）逐漸變尖和增強(qiáng)（圖1b），表明共軛骨架內(nèi)的潛在二自由基性質(zhì)。此外，為了避免分子旋轉(zhuǎn)在高溫區(qū)域表征2PhNVDPP的二自由基性質(zhì)時產(chǎn)生干擾，在不同濃度下進(jìn)行了1H NMR測量。在將2PhNVDPP濃度提高到30mM以抑制分子旋轉(zhuǎn)后，質(zhì)子峰仍然表現(xiàn)出加寬，揭示了2PhNV的二自由基性質(zhì)。

為了更好地了解兩種二自由基的自由基物種和自旋多樣性變化，使用相同量的固態(tài)每種化合物進(jìn)行了VT ESR測量（圖1c、d）。固態(tài)2PhNVDPP和PhNVDPP的ESR信號表現(xiàn)出2.0030的g因子，表明存在未配對的碳中心自由基。由于2PhNVDPP增強(qiáng)了分子內(nèi)D-A相互作用，促進(jìn)了自旋離域并反映了其二自由基特性，因此其ESR信號比PhNVDPP更強(qiáng)。兩個樣品的ESR信號強(qiáng)度的增加與粉末測量結(jié)果一致，在2PhNVDPP中表現(xiàn)出更明顯的開殼形式（圖1e）。然而，ESR信號從固體到溶液減弱。因此，這些二自由基性質(zhì)背后的驅(qū)動力可能歸因于共軛誘導(dǎo)的離域能增強(qiáng)和聚集狀態(tài)下的分子內(nèi)運(yùn)動受限。

圖2. 光物理和光熱特性的表征

獲得了PhNVDPP和2PhNVDPP的紫外-可見近紅外吸收光譜和PL光譜。PhNVDPP和2PhNVDPP的最大吸收峰分別在677和720 nm處測量（圖2a）。與PhNVDPP相比，2PhNVDPP表現(xiàn)出明顯的約43 nm的紅移。這種轉(zhuǎn)變歸因于四個供體單元的摻入，這增強(qiáng)了分子內(nèi)D-A相互作用，導(dǎo)致更強(qiáng)的電子自旋離域和2PhNVDPP的更長吸收波長此外，這兩種二自由基類化合物都表現(xiàn)出延伸至1300 nm的NIR-II發(fā)射（圖2b）。這一發(fā)現(xiàn)有望極大地推動二自由基類化合物在高分辨率近紅外-II FLI研究中的應(yīng)用。PhNDVDPP的PL光譜顯示出多個發(fā)射峰，這可能是由于其溶解度差，在THF溶液中形成了不同大小和形態(tài)的聚集體。

為了獲得用于生物應(yīng)用的水分散NPs，將PhNVDPP和2PhNVDPP封裝在兩親性共聚物基質(zhì)DSPE-PEG2000中。通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態(tài)光散射（DLS）分析證實(shí)了PhNVDPPNPs和2PhNVDPP NPs的均勻球形形態(tài)，分別顯示平均流體動力學(xué)尺寸為57和117 nm（圖2c）。此外，還評估了上述NPs的紫外-可見近紅外吸收和PL光譜。吸收光譜在500-950 nm處顯示出寬的吸收范圍，PhNVDPPNPs的最大吸收波長為DPP NPs和2PhNVDPP NPs分別在595和703 nm處（圖2d）。2PhNVDPP NPs在808 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε）為1.8×104 M–1 cm–1，是PhNVDPP NPs（0.29×104 M-1cm–1）的6倍這清楚地表明2PhNVDPP NPs具有顯著強(qiáng)的近紅外光吸收特性，這對于開發(fā)新型納米藥物和高性能光療研究至關(guān)重要。此外，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs分別在929和1013 nm處顯示出最大發(fā)射峰（圖2e）。PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs的熒光量子產(chǎn)率（QYs）分別為0.05%和0.15%。通過測定QY×ε值來評估NIR-II熒光亮度。2PhNVDPP NPs在850-1500 nm光譜范圍內(nèi)的亮度值為45.3，是PhNVDPP NPs（16.8）的2.7倍。

利用長波長和優(yōu)異的光吸收性能，我們研究了含有2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的水溶液在808 nm激光照射下的光熱性能。在808nm激光照射下，純水溶液沒有明顯的溫度變化（圖2f）。值得注意的是，2PhNVDPP NPs水溶液的溫度變化與溶液濃度和808 nm激光的功率密度呈正相關(guān)（圖2f，g）。在暴露于808 nm激光（0.5 W cm–2）照射5分鐘后，含有2PhNVDPP NPs（50μM）的溶液的溫度從20.0°C升高到61.5°C，從而有利于其二自由基PTT應(yīng)用。計(jì)算出2PhNVDPP NPs的PCE為53%（圖2h）在808 nm激光照射（0.5 W cm–2）下，含37%PCE的PhNVDPP NPs（50μM）的水溶液溫度從20.1°C升至47.7°C（圖2i）。因此，2PhNVDPP NPs顯示出優(yōu)異的光熱性能，突出了它們在實(shí)體瘤PTT方面的潛力。

阻礙二自由基類化合物更廣泛利用的主要限制是其固有的不穩(wěn)定性。首先，通過間歇打開和關(guān)閉808 nm激光（0.5 W cm–2），以FDA批準(zhǔn)的臨床熒光染料吲哚菁綠（ICG）作為對照，評估2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的光熱穩(wěn)定性。2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs即使在五次加熱-冷卻循環(huán)后也保持穩(wěn)定（圖2j），顯示出優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。隨后，在808 nm（0.5 W cm–2）激光照射下研究了2PhNVDPP和PhNVDPP NPs的光穩(wěn)定性。連續(xù)激光照射20分鐘后，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs的時間依賴性熒光強(qiáng)度沒有明顯變化（圖2k）。然而，ICG中明顯存在明顯的光漂白效應(yīng)。這些結(jié)果表明，PhNVDPP NPs和2PhNVDPP NPs溶液顯示出非凡的熒光光穩(wěn)定性。此外，我們對兩種二自由基類化合物進(jìn)行了熱重分析，以確定其熱穩(wěn)定性。2PhNVDPP的熱分解溫度為322°C，高于307°C的PhNVDPP（圖2l）。在與GSH或H2O2孵育不同時間后，2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的吸收光譜僅略有變化，表明其具有相對較好的生物穩(wěn)定性。同時，在7天的監(jiān)測期間，它們的粒徑?jīng)]有顯著變化?？偟膩碚f，這些結(jié)果證明了這兩種二自由基在光照射、熱條件和生理環(huán)境下的穩(wěn)定性。

圖3. 體外細(xì)胞成像和細(xì)胞活力測定

使用HeLa細(xì)胞作為模型細(xì)胞系研究了2PhNVDPP NPs和PhNVDPP NPs的細(xì)胞成像和亞細(xì)胞分布（圖3）。共聚焦激光掃描顯微鏡分析顯示，2PhNVDPP NPs和線粒體染色探針MitoTracker Green之間共定位，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.839（圖3a），突顯了2PhNVDPP NPs對線粒體的顯著靶向能力。此外，探針BODIPY 493/503觀察到PhNVDPP NPs對脂滴的高度特異性，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.887（圖3b）。

接著進(jìn)一步研究了2PhNVDPP NPs的體外抗腫瘤性能。最初，在沒有808nm激光照射的情況下，2PhNVDPP NPs的細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)，表明它們對進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的安全性和適用性（圖3c）。在暴露于NIR激光照射（808 nm，0.5 W cm–2）12分鐘后，觀察到與2PhNVDPP NPs孵育的癌癥細(xì)胞的死亡顯著增加。隨著2PhNVDPP NPs濃度從0增加到45μM，細(xì)胞存活率從100%降低到16%，表明2PhNVDPP NPs具有有效的抗腫瘤特性。2PhNVDPP NPs的半數(shù)最大抑制濃度（IC50）接近28μM。相比之下，即使在45μM和808nm的高濃度激光照射下，使用PhNVDPP NPs也觀察到超過95%的細(xì)胞存活率，表明PhNVDPP NPs對腫瘤細(xì)胞的光毒性較弱（圖3d）。因此，2PhNVDPP NPs更適合光熱抗腫瘤治療。

此外，我們進(jìn)行了活/死模擬，以觀察2PhNVDPP NPs的光熱細(xì)胞毒性，其中鈣黃綠素AM的綠色熒光表示活細(xì)胞，PI的紅色熒光表示死細(xì)胞。用2PhNVDPP NPs（50μM）或激光照射（808 nm，0.5 W cm–2）處理12分鐘的細(xì)胞僅顯示強(qiáng)烈的綠色熒光，表明對細(xì)胞存活率沒有影響（圖3e）。在暴露于2PhNVDPP NPs和激光照射6和12分鐘后，細(xì)胞熒光信號逐漸從綠色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色熒光，最終在照射12分鐘后通過光療抑制細(xì)胞活力。結(jié)果表明，2PhNVDPP NPs表現(xiàn)出優(yōu)異的PTT性能，使其可用于進(jìn)一步的體內(nèi)應(yīng)用。

由于線粒體是2PhNVDPP NPs靶向的亞基，因此檢測了經(jīng)PTT處理的HeLa細(xì)胞的線粒體膜電位（MMP），以研究光熱對MMP的影響。在黑暗中將HeLa細(xì)胞與2PhNVDPP NPs和JC-1共培養(yǎng)后，未檢測到MMP的顯著變化。然而，暴露于808 nm激光（0.5 W cm–2）12分鐘導(dǎo)致綠色熒光逐漸增加，綠色與紅色熒光強(qiáng)度的比值增加了1.2倍（圖3f，g）。這一結(jié)果表明，PTT誘導(dǎo)線粒體破壞，隨后MMP減少。因此，2PhNVDPP NPs在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有巨大潛力，特別是在近紅外光激活的PTT方面。

圖4. 2PhNVDPP NPs的體內(nèi)高對比度NIR-II熒光成像和光熱治療

為了評估地拉西烷類化合物的NIR-II成像能力，我們利用2PhNVDPP NPs在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行了高對比度NIR-II全身血管FLI。該評估涉及砷化銦鎵（InGaAs）探測器與不同長通（LP）濾光片（900、1000、1100和1300 nm）的結(jié)合使用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，使用808nm激光作為激發(fā)光，它可以深入生物組織而不會傷害小鼠。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，小鼠腹部血管變得可識別（圖S30）。重要的是，使用LP濾波器在900、1000、1100和1300 nm處捕獲的圖像分別顯示出1.09、1.15、1.26和5.03的SBR依次提高。2PhNVDPP NPs的體內(nèi)成像結(jié)果證明了它們適用于NIR-II二自由基成像。

為了確定體內(nèi)PTT的最佳治療時間，研究者使用NIR-II FLI研究了2PhNVDPP NPs在4T1荷瘤裸鼠模型中的積累（圖4a）。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，腫瘤區(qū)域的實(shí)時NIR-II熒光強(qiáng)度信號逐漸增加。信號在注射后9小時達(dá)到最高熒光亮度，與初始注射相比增加了1.35倍（圖4b）。靜脈注射2PhNVDPP NPs后，小鼠腹部血管變得可識別。重要的是，使用LP濾波器在900、1000、1100和1300 nm處捕獲的圖像分別顯示出1.09、1.15、1.26和5.03的SBR依次提高。2PhNVDPP NPs的體內(nèi)成像結(jié)果。

本文進(jìn)一步研究2PhNVDPP NPs在FLI引導(dǎo)的PTT在4T1乳腺腫瘤攜帶BALB/c小鼠上的應(yīng)用，皮下腫瘤體積為100 mm3，作為動物模型（圖4c）。對于2PhNVDPP NPs+L組，腫瘤溫度在2分鐘內(nèi)從35.2°C迅速升高到44.3°C，隨后穩(wěn)定在約49.5°C（圖4f），有利于腫瘤消融。相反，在激光照射后，PBS+L組觀察到溫度略有升高（ΔT=3.7°C），表明在沒有2PhNVDPP NPs的情況下光熱效應(yīng)最小。連續(xù)15天每3天測量一次所有組的腫瘤體積和體重。治療15天后采集了腫瘤組織的代表性圖像（圖4e）。PBS、PBS+L和2PhNVDPP NPs組對腫瘤的生長抑制沒有差異。相比之下，對于2PhNVDPP NPs+L組，觀察到幾乎抑制了腫瘤進(jìn)展，治療后15天內(nèi)未觀察到復(fù)發(fā)（圖4g）。此外，在15天的治療期間，各組體重沒有明顯差異，表明2PhNVDPP NPs治療在808 nm激光照射下對小鼠的毒性作用最?。▓D4h）。因此，這些結(jié)果表明，2PhNVDPP NPs具有作為具有成像和治療功能的光療劑的潛力。

總之，研究者通過采用受體平面化、π共軛擴(kuò)展和供體旋轉(zhuǎn)的協(xié)同操縱策略，成功制備了高度穩(wěn)定的NIR-II發(fā)光二自由基光致變色劑。通過在DPP受體核心側(cè)翼引入共軛二烯并在分子骨架上外部添加4-（N，N-二甲氨基）苯基，合成了兩種創(chuàng)新的二自由基化合物2PhNVDPP和PhNVDPP。這兩種二自由基類化合物都表現(xiàn)出的NIR-II發(fā)射，延伸到1300 nm。單晶結(jié)構(gòu)分析表明，共軛二烯DPP受體核的高平面性和分子兩端扭曲供體的空間位阻通過增強(qiáng)自旋離域和抑制分子間π-π堆積效應(yīng)，共同促成了高度穩(wěn)定的NIR-II二自由基發(fā)光性能。在形成水分散性NPs后，2PhNVDPP NPs表現(xiàn)出增強(qiáng)的NIR光收集能力，在808nm處的摩爾吸光系數(shù)是PhNVDPP NPs的6倍。更重要的是，憑借出色的穩(wěn)定性、良好的生物相容性、53%的PCE和NIR-II發(fā)射能力，2PhNVDPP NPs成功地促進(jìn)了高質(zhì)量的全身血管和腫瘤成像。此外，2PhNVDPP NPs已被用于NIR-II FLI引導(dǎo)的PTT體內(nèi)抗腫瘤。據(jù)我們所知，據(jù)報(bào)道，2PhNVDPP是用于成像引導(dǎo)的癌癥治療的具有NIR-II熒光發(fā)射的開創(chuàng)性穩(wěn)定的雙向光鏡劑。這項(xiàng)研究有望激勵研究人員開發(fā)穩(wěn)定的NIR-II發(fā)光二羥基化合物，并促進(jìn)NIR-II二羥基化合物染料在成像引導(dǎo)疾病診斷和治療中的廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

Feng L, Tuo Y, Wu Z, et al. Highly Stable Near-Infrared II Luminescent Diradicaloids for Cancer Phototheranostics[J]. Journal of the American Chemical Society, 2024, 146(47): 32582-32594.