mRNA-LNP疫苗制備流程與免疫評價(jià)實(shí)驗(yàn)方案分享

mRNA疫苗的核心是其序列設(shè)計(jì)。本研究中使用的mRNA序列包含5'非翻譯區(qū)（UTR）、編碼5種抗原的序列、GFP報(bào)告基因、3'UTR以及聚腺苷酸（PolyA）尾。5'和3'UTR序列對于mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率至關(guān)重要，通常來源于高表達(dá)基因的UTR區(qū)域，如α-珠蛋白基因。PolyA尾不僅促進(jìn)有效翻譯，還能增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，可通過DNA模板編碼或在體外轉(zhuǎn)錄后添加。此外，質(zhì)粒中還設(shè)計(jì)了特定的限制酶位點(diǎn)，便于質(zhì)粒DNA的線性化，為后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄（IVT）做準(zhǔn)備。

質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備是mRNA合成的基礎(chǔ)。通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化，使用STBL3大腸桿菌細(xì)胞放大編碼mRNA模板的質(zhì)粒DNA。這一過程包括將少量質(zhì)粒DNA與細(xì)菌細(xì)胞混合、熱激處理、培養(yǎng)以及篩選單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增。最終，使用市售的無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA分離試劑（如Promega的PureYield Plasmid Maxiprep System）提取質(zhì)粒DNA，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

樹突狀細(xì)胞（DCs）是專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，在啟動免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，通過從6-8周齡小鼠的骨髓中分離細(xì)胞，并在GM-CSF的作用下培養(yǎng)分化成BMDCs。這一過程需要精確的細(xì)胞操作和培養(yǎng)條件控制，以確保獲得高質(zhì)量的BMDCs，用于后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)。

B16F10黑色素瘤細(xì)胞系用于模擬腫瘤環(huán)境，評估疫苗的抗腫瘤效果。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至少在解凍后3-7天收集，以確保細(xì)胞從解凍過程中恢復(fù)，保持良好的生長狀態(tài)。收集的細(xì)胞用于后續(xù)的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，以評估疫苗的保護(hù)效果。

mRNA的合成是疫苗制備的關(guān)鍵步驟。使用線性化的DNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（IVT），并在反應(yīng)中加入CleanCap AG和N1-甲基偽尿苷-5'-三磷酸（m1c），以減少mRNA的免疫原性并提高翻譯效率。合成后的mRNA通過Agilent RNA 6000 Nano kit assay進(jìn)行質(zhì)量控制，確保mRNA的純度和完整性。此外，通過dot-blot分析檢測IVT RNA樣本中的雙鏈RNA（dsRNA）含量，因?yàn)閐sRNA可能具有免疫原性，影響疫苗的安全性和有效性。

圖 1 .mRNA 純度和免疫原性的表征

為了評估m(xù)RNA的免疫原性，使用THP-1細(xì)胞系檢測IVT mRNA封裝在脂質(zhì)體中的I型干擾素反應(yīng)。這一檢測不僅有助于評估m(xù)RNA本身的免疫原性，還能反映LNP封裝對mRNA免疫原性的影響。通過量化細(xì)胞上清中的干擾素水平，可以篩選出免疫原性較低的mRNA構(gòu)建體，為疫苗的安全性提供保障。

mRNA-LNP的制備是疫苗遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將mRNA封裝在LNP中，以保護(hù)mRNA免受降解，并促進(jìn)其通過內(nèi)吞/吞噬途徑進(jìn)入細(xì)胞。本期文章將繼續(xù)分享mRNA-LNP的制備流程，包括含、RNA的水相樣品準(zhǔn)備和微流控法包封mRNA-LNP。

LNP的脂質(zhì)組分是影響其性能的關(guān)鍵因素之一。常用的LNP配方包括可電離脂質(zhì)、磷脂DSPC、膽固醇和穩(wěn)定劑，其摩爾比為50:10:37.5:2.5。這種配方經(jīng)過優(yōu)化，能夠有效地保護(hù)mRNA，促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的釋放，并減少免疫原性。

在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)不同的mRNA疫苗或藥物的需求，脂質(zhì)的摩爾比例和總濃度可能會有所調(diào)整。例如，BioNTech的BNT-162b2、Moderna的mRNA-1273以及Alnylam的Onpattro等獲批用于人體的LNP配方，其脂質(zhì)組分和摩爾比例各有特點(diǎn)，以適應(yīng)不同的治療目標(biāo)和遞送需求。

7.3 微流控包封：

7.4 理化數(shù)據(jù)檢測：

圖 2 .新鮮和冷凍 mRNA-LNPs 的理化及穩(wěn)定性特性的測定

在B16F10癌細(xì)胞系和BMDCs中轉(zhuǎn)染mRNA疫苗后，使用抗H2-Kb/SIINFEKL-PE偶聯(lián)抗體檢測SIINFEKL肽在H2-Kb上的呈遞。這一實(shí)驗(yàn)步驟不僅驗(yàn)證了mRNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)的翻譯和抗原呈遞能力，還作為質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確保疫苗能夠有效激活免疫系統(tǒng)。

在小鼠模型中，通過尾靜脈注射mRNA-LNP疫苗進(jìn)行免疫，評估其誘導(dǎo)的抗原特異性CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)。使用四聚體肽-MHC-I復(fù)合物（tetramers）檢測抗原特異性T細(xì)胞，為疫苗的免疫原性提供直接證據(jù)。此外，通過腫瘤挑戰(zhàn)模型評估疫苗的抗腫瘤效果，以腫瘤生長作為指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證疫苗的實(shí)際應(yīng)用潛力。

9.1 第 1 - 5 天：給小鼠進(jìn)行免疫：

1. 通過腹腔注射 0.1ml 20% Ketamine、10% Pentobarbital Sodium混合液（用蒸餾水稀釋）使小鼠麻醉（假設(shè)小鼠體重為 25 克，麻醉液的注射量應(yīng)根據(jù)體重和麻醉反應(yīng)進(jìn)行調(diào)整）。
2. 每只小鼠通過眼眶后注射 125μl 1 倍 PBS 稀釋的 10μg mRNA-LNP 進(jìn)行免疫。作為陰性對照，用 1 倍 PBS 對小鼠進(jìn)行免疫（圖 4A）。注意：mRNA-LNP 疫苗可通過其他途徑給藥，如肌肉注射、皮內(nèi)注射、皮下注射或鼻內(nèi)注射。不同的給藥途徑會對免疫反應(yīng)的動態(tài)和特性產(chǎn)生不同的影響。
3. 在第 5 天給予加強(qiáng)劑量，即 10μg mRNA-LNP 或 1 倍 PBS 作為陰性對照。

9.2 第 8 天：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和脾細(xì)胞：

圖 4. mRNA-LNP 疫苗接種后抗原特異性 T 細(xì)胞的誘導(dǎo)及抗腫瘤免疫反應(yīng)

本研究詳細(xì)介紹了mRNA脂質(zhì)納米顆粒疫苗的開發(fā)流程和小鼠免疫效率分析的實(shí)驗(yàn)方案。從mRNA序列設(shè)計(jì)到LNP封裝，再到小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，每一步都經(jīng)過精心設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的質(zhì)量控制。通過這一方案，我們能夠開發(fā)出具有高效免疫原性和良好安全性的mRNA疫苗，為預(yù)防和治療疾病提供新的策略。盡管實(shí)驗(yàn)過程中存在一些局限性，如僅測量IFN-I反應(yīng)來評估m(xù)RNA免疫原性，以及依賴特定抗體來測量抗原呈遞，但通過不斷優(yōu)化和改進(jìn)，mRNA疫苗技術(shù)有望在未來的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

參考文獻(xiàn)：[1] Karekar N, Reid Cahn A, Morla-Folch J, Saffon A, Ward RW, Ananthanarayanan A, Teunissen AJP, Bhardwaj N, Vabre. Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice. STAR Protoc. 2024 Jun 21;5(2):103087. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103087.