Cytena UP.SIGHT單細胞打印機的應用

時至今日，被引進于臨床治療的單克隆抗體已多達數(shù)十種，而全球每年基于單克隆抗體研發(fā)的藥物市場規(guī)模更是達到近1000億美元。生產(chǎn)這些重組蛋白泛采用的細胞系是工程化的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）。根據(jù)美國聯(lián)邦藥物管理局（FDA）和其他監(jiān)管機構發(fā)布的早期監(jiān)管指南說明，這些重組蛋白的生產(chǎn)細胞系必須是從單個祖細胞克隆來源的。一方面，這是為了最大限度地減少種群異質(zhì)性，從而促進高產(chǎn)克隆的分離和后續(xù)選擇；另一方面，快速生長但產(chǎn)量低的克隆細胞會過度生長，影響重組蛋白的產(chǎn)率。因此，單細胞克隆篩選是生物制藥行業(yè)生產(chǎn)單克隆抗體的重要步驟。

目前用于克隆細胞系開發(fā)的自動化單細胞分離方法中，最常見的主要包括有限稀釋、熒光激活細胞分選（FACS）和單細胞分選。除了保證單克隆性外，任何克隆工作流程的另一個重要方面是實現(xiàn)高克隆效率，即最大限度地提高每個平板上活克隆培養(yǎng)物的百分比。使用CHO細胞和其他細胞系，通過單細胞分配實現(xiàn)了高細胞活力和克隆效率。然而，在實踐中，細胞樣本通常含有大量死亡或難以生長的細胞，這可能導致克隆恢復率低。在工業(yè)細胞系開發(fā)工作流程中，只有20%的分離單細胞生長為可用的克隆并不少見。此問題可能是由于樣品制備過程造成的細胞損傷。因此，尋找一種單細胞分離方法，允許選擇可能增殖并形成菌落的細胞，將是非常有益的。

德國 Cytena 公司開發(fā)的單細胞分離篩選系統(tǒng) UP.SIGHT，通過自動化方式替代勞動密集和耗時的步驟來簡化細胞系開發(fā)的工作流程。將具有高效、快速和溫和的單細胞分選技術與超快速、高質(zhì)量的成像系統(tǒng)相結合，可實現(xiàn)噴嘴成像和3D全孔成像，從而通過獨 立的光學設備雙重保證單克隆性。

1單克隆細胞系的雙重保證

UP.SIGHT 基于頂端的透明微型分配芯片，用于從細胞懸液中按需生成微滴。分配器芯片是一個包含微流體結構的硅玻璃化合物，被稱為劑量室的背面有一個具有彈性的黑色硅膜(圖b)，它被一個壓電板制動器所擠壓偏轉， 這種擠壓偏轉導致腔體內(nèi)的液體位移而使得液滴從噴嘴噴出來。

配合安裝在芯片噴嘴正下方的可控微氣動快門系統(tǒng)在空液滴和含多個細胞的液滴通過時，自動打開，液滴則被吸走；在單細胞液滴通過時，快門系統(tǒng)自動關閉，結果只有含單個細胞的液滴被分離篩選到孔板中(圖f)。

UP.SIGHT 提供了兩種獨立可確保單克隆性的方法。首先，高分辨率的相機在分配噴嘴處拍攝高清圖像，以確保僅含一個細胞的液滴進入孔內(nèi)。如果在噴嘴內(nèi)檢測到一個以上的細胞或沒有細胞，則將丟棄該非單細胞液滴。更重要的是，UP.SIGHT通過一種創(chuàng)新的3D全孔成像技術再次確認進入孔內(nèi)的單個細胞，該方法可對每個孔的全部液體體積進行成像，從而消除了孔板為鬼孔或偽影和邊緣問題的影響 。噴嘴圖像和孔內(nèi)的3D成像雙重保證使單細胞篩選率達到99.99 %。

2更高的產(chǎn)量，更好的成像，更快的進程

UP.SIGHT將單細胞分選技術與行業(yè)的成像系統(tǒng)相結合，可改善單細胞克隆工作流程，從而實現(xiàn)更高的克隆產(chǎn)量和加快細胞系開發(fā)進程。在分離細胞的前后過程會連續(xù)拍取多張細胞圖片并儲存在磁盤中以便追蹤，還具有一套細胞識別算法的圖像處理軟件，能將圖像中的細胞與背景、灰塵、細胞碎片以及聚團細胞或者振動和流體動力學引起的變化等區(qū)分開來。

在細胞正式分選到孔板之前，根據(jù)樣品細胞的分布情況，包括直徑大小分布、圓度分布和熒光強度分布等特性，可進行細胞直徑、細胞圓度和細胞熒光強度的參數(shù)設定。當進行正式分選時，只有同時滿足三個參數(shù)的單細胞才能被分離篩選在孔板中。

每個參數(shù)閾值的快速直觀設置可確保僅將所需細胞分配到孔中，以產(chǎn)生更多的單克隆。這種自動化和高效的處理速度可在幾分鐘內(nèi)完成對成百上千個單細胞的分離并成像，而所需的手工時間只有幾分鐘。

3功能！減少細胞丟失

UP.SIGHT含有Cell Focusing的功能, 在分選過程中，開啟此功能可以將正要通過噴嘴的細胞輕柔地集中在中間位置，使細胞被排成了一列，依次通過。該技術能改善光學配件的影響，能夠更好地對細胞進行形態(tài)學上的分析，提高分選速度。特別在處理稀有類型細胞時，能夠減少細胞的丟失率。

UP.SIGHT單細胞分離篩選系統(tǒng)實現(xiàn)了一體化的細胞系開發(fā)工作流程，是一款多功能、高通量的單細胞分選工具，可極大加快抗體細胞株的開發(fā)。目前已成功應用于：

1抗體研發(fā)領域和細胞治療領域的單克隆篩選2單細胞基因組學3單細胞PCR4稀有細胞的分離