機械力調(diào)節(jié)脂肪干細胞的旁分泌功能促進大鼠皮膚擴張

Mechanical force regulates the paracrine functions of ADSCs to assist skin expansion in rats

Keywords: ADSC paracrine; Angiogenesis; Collagen secretion; Mechanical force; Skin expansion.

由手術(shù)切除、創(chuàng)傷、燒傷和慢性潰瘍引起的大范圍軟組織缺損嚴重增加了發(fā)病率和死亡率，這仍然是整形外科中具挑戰(zhàn)性的問題。組織擴張術(shù)可消除遠距離組織移植引起的供區(qū)并發(fā)癥，擴張后的皮膚組織與修復(fù)區(qū)皮膚質(zhì)量相似。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）由于其的組織再生能力成為一種很有前途的治療選擇。與其他類型的 MSCs 相比，脂肪來源的干細胞（ADSCs）因其取材容易、含量豐富而受到廣泛關(guān)注。然而，移植后 MSCs 的遷移能力、存活率和分化能力下降，這限制了它們的治療潛力。越來越多的證據(jù)表明，旁分泌功能是 MSC 治療效果的核心。MSCs可以釋放多種功能分子，如生長因子、炎癥因子、趨化因子、細胞外基質(zhì)成分等。一些研究表明，ADSCs 的條件培養(yǎng)基（ADSC-CM）具有促進組織再生的潛力。

MSCs可以通過缺氧、基因工程和物理化學刺激進行預(yù)處理，以擴增或抑制特定的生物分子，從而達到預(yù)期的治療效果。機械刺激可誘導 ADSCs 分泌促進血管生成的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。機械力在不同程度上調(diào)控 ADSCs 的遷移、分化和旁分泌功能。

基于此，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院整形美容外科研究團隊假設(shè)，在特定機械力下收集的 ADSC-CM 可以通過促進血管生成和膠原蛋白分泌來促進皮膚再生。為此，將ADSCs 暴露于不同程度的機械力探索了機械力的大小與 ADSCs 旁分泌功能之間的關(guān)系，并使用大鼠皮膚擴張模型研究了 ADSC-CM 在皮膚擴張中的作用和潛在機制。研究成果發(fā)表在 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Mechanical force regulates the paracrine functions of ADSCs to assist skin expansion in rats”。

為了研究 ADSC-CM 對血管生成的影響并確定最合適的機械預(yù)處理，首先研究了在不同拉伸強度下（0%；10%；12%；15%）收集的 ADSC-CM 對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的影響，比較 ADSC-CM 對這些細胞增殖、遷移和血管生成管形成的影響。劃痕測定表明，10% 拉伸組最能促進這些細胞的遷移（圖1 a、b）。CCK8 實驗結(jié)果顯示，各拉伸組吸光度變化與對照組無顯著差異（圖1 c）。細胞開始形成毛細血管后，10% 拉伸組在6小時時管腔形成最好（圖1 d、e、f）。然后，觀察在不同拉伸力下收集的 ADSC-CM 對大鼠成纖維細胞的影響，研究 ADSC-CM 對膠原蛋白分泌的影響，發(fā)現(xiàn)10% 拉伸組中的成纖維細胞分泌更多的 Col I 和 Col III （圖1 g）。這表明，在機械拉伸下收集的 ADSC-CM 促進大鼠主動脈內(nèi)皮細胞的遷移、血管生成和成纖維細胞的膠原蛋白分泌。

圖1    不同機械力下收集的 ADSC-CM 對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的影響。（a）劃痕測定中大鼠主動脈內(nèi)皮細胞在 12 小時和 24 小時的遷移。（b）劃痕測定的定量分析。（c）CCK8 活力測定大鼠主動脈內(nèi)皮細胞在 24、48 小時的細胞增殖能力。（d）在試管形成試驗中大鼠主動脈內(nèi)皮細胞在 6 小時時的試管形成能力。（e、f）試管形成測定的定量分析。（g）成纖維細胞分泌 Col I 和 Col III 的qPCR 分析。

根據(jù)體外實驗的結(jié)果，將在 0% 和 10% 的拉伸力下收集的 ADSC-CM 作用于大鼠的擴張區(qū)域，發(fā)現(xiàn)10% 拉伸組的擴張率顯著高于其他組，而 0% 拉伸組和對照組之間無顯著差異。這說明，機械力作用下收集的 ADSC-CM 可改善皮膚擴張。

然后，對 CD31 進行免疫熒光染色以確定中央?yún)^(qū)域的血管密度。在第3天和第7天，10%拉伸組的血管數(shù)量顯著高于其他組，但在第14天各組之間無顯著差異（圖2）。這說明，機械力作用下收集的ADSC-CM可改善擴張皮膚的血管化。

圖2    在機械力暴露的ADSC-CM存在下皮膚擴張后血管化的評估。（a）通過免疫熒光染色評估 CD31 分別在中央和側(cè)面區(qū)域擴增 7 天后的血管生成。（b）定量分析中心區(qū)域的毛細管密度。

為了闡明在 10% 拉伸力下收集的 ADSC-CM 改善擴張皮膚血管形成的機制，通過 qPCR 研究了擴增皮膚中選定蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果顯示，10% 拉伸組 VEGF、HGF 和 bFGF 的表達顯著高于其他組，表明在機械力作用下收集的 ADSC-CM 增加了血管生成相關(guān)蛋白的表達。

為了評估擴張皮膚中膠原蛋白的數(shù)量，在每個時間點進行免疫組織化學和組織學分析。在第 30 天，10% 拉伸組的 Col I 和 Col III 水平升高，但 0% 拉伸組和對照組之間沒有顯著差異（圖3），且三組皮膚厚度也無顯著差異。這表明，在機械力作用下收集的 ADSC-CM 增加了擴張皮膚中的膠原蛋白沉積。

圖3    評估在機械力暴露的 ADSC-CM 存在下皮膚擴張后膠原蛋白沉積的情況。（a）擴增 30 天后 Col I 的免疫組織化學。（b）擴增 30 天后 Col III 的免疫組織化學。（c）Col I 和 Col III 水平的定量分析。

圖4    機械預(yù)處理ADSC-CM協(xié)助皮膚擴張的可能機制

在這項研究中，證實了機械力可以調(diào)節(jié) ADSCs 的旁分泌功能，確定了優(yōu)化 ADSCs 分泌蛋白組以促進血管生成和膠原沉積的最佳機械條件，并將 ADSC-CM 應(yīng)用于擴張的區(qū)域以促進皮膚再生（圖4）。研究結(jié)果強烈表明，利用機械預(yù)處理后收集的 ADSC-CM 進行皮膚擴張，增加了新生皮膚的血管生成和膠原蛋白含量，不會導致皮瓣過度增厚，從而為超薄大皮瓣的擴張?zhí)峁┝烁玫臈l件，以修復(fù)大塊的軟組織缺損。

參考文獻：Xue Z, Hu D, Tang H, Xue M, Zhu Y, Li Y, Liao Y. Mechanical force regulates the paracrine functions of ADSCs to assist skin expansion in rats. Stem Cell Res Ther. 2024 Aug 13;15(1):250. doi: 10.1186/s13287-024-03822-0. PMID: 39135129; PMCID: PMC11321134.

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