人神經干細胞培養(yǎng)方法及誘導形成腦類器官

三、人神經干細胞培養(yǎng)方法

準備神經干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基

1、NSCwan全培養(yǎng)基需要補充NSC補充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺。

2、在無菌環(huán)境中，依次將20mL NSC補充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中，此時即得神經干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基(abs9821)。

3、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。

注意：在所有成分的有效期限內，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲存，可穩(wěn)定長達4周。

注意：可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng)。

包被孔板

1、基質膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內加入1mL/0.5mL即用型基質膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內使用。

2、在使用前，將已經平衡好的即用型基質膠棄掉，然后加入預熱的wan全NSC培養(yǎng)基。

NSC傳代

1、當細胞密度達到90-100%的融合度時，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。

2、用5mL不含鈣和鎂的預溫DPBS洗滌細胞，然后吸棄溶液。

3、在每個培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預熱的人多能干細胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保wan全覆蓋細胞。

4、用倒置顯微鏡觀察細胞是否脫離。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進細胞脫離。

5、輕輕上下移液，使團塊分散到單個細胞懸液中。

6、加入9mL預熱好的NSC wan全培養(yǎng)基停止細胞解離反應，然后將細胞懸液轉移到無菌離心管中。

7、200×g離心4min。

8、丟棄上清，然后用適量NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀。

9、用自動細胞計數器測定總活細胞密度。

10、從每個覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預熱的NSC wan全培養(yǎng)基，添加Y27632（終濃度10μM）。

11、在每個培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細胞/cm²(例如，1.25×10⁶細胞/T-25培養(yǎng)瓶)，然后混合或旋轉細胞懸液以確保均勻分布。

12、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

注：為了獲得最佳性能和細胞生長，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的預熱的NSC wan全培養(yǎng)基。

NSC凍存

1、準備干細胞凍存液(abs9412)。

2、按照“NSC傳代”中的步驟1至步驟7收集細胞進行冷凍保存。

3、在離心過程中，計算細胞密度為2×10⁶個活細胞/mL所需的最終體積。

注：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液。

4、丟棄上清，然后用NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞。

5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO。

6、立即將細胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）。

7、按照標準程序（每分鐘降低1°C）在自動或手動控制速率的冷凍設備中實現低溫保存。

8、將冷凍細胞轉移到液氮中。

NSC復蘇

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細胞。

2、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中。

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預熱好NSC wan全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉離心管混合。

4、繼續(xù)添加預熱的NSC wan全培養(yǎng)基至10mL。

5、200×g離心4min，確認細胞沉淀，丟棄上清。

6、加入5mL預熱好NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內容物轉移到包被的組織培養(yǎng)瓶中。

7、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

8、復蘇后24h用新鮮的預熱過的NSC wan全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

注：為了恢復在NSC中生長的細胞，我們建議在初始傳代時以≥1×10⁵個細胞/cm²的密度接種細胞。

四、人神經干細胞誘導形成腦類器官

原代

一、準備工作

1、儀器設備

CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）。

2、劑耗材（以腸癌為例）

動物腦類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs90050)、基質膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒。

二、操作流程

1、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準備工作

a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

干細胞團沉淀

消化收集神經干細胞團到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

密度建議1：基質膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質膠足夠）

密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。

鋪板密度

胎羊及胎鼠類器官生長圖

傳代（消化分兩種情況）

一、類器官數量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

3）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、類器官消化

1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細胞團為主，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質膠量25*10=250uL

密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數類器官直徑在200-300um，可進行傳代操作。

二、類器官數量不足或體積較小時：

1、類器官收集、吹打、洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質膠。

2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）；

3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

4）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留細胞團沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠細胞團混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠細胞團混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質膠量25*3=75uL

密度建議2：500個細胞團/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基 A進行培養(yǎng)。大概7-10天，多數類器官直徑在200-300um，可進行再次傳代。

凍存

凍存要領:

類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）；

在類器官指數增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數類器官直徑在100um-200um，這個時機選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌

1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

3、接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

二、類器官凍存

1、凍存密度，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL凍存液

密度建議2：500個類器官/mL凍存液（如果想計數凍存，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，建議立即進行凍存。（放置太久，DMSO對類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

     手動凍存：4℃冰箱放置30min，轉移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

復蘇

一、實驗前準備

1、將水浴鍋預熱至37℃；

2、細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

二、取出凍存管

1、根據類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號。

2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。

三、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化。

2、約1-2min后凍存管內液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內。

四、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。

五、加膠-點板-加液

1、準備工作

（1）基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

（3）融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

2、復蘇要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質膠類器官混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3、復蘇密度

復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復蘇幾孔）

復蘇密度建議2：250個類器官/25uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

4、加膠-點板

向類器官沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），然后進行點板。整個操作在金屬冰盒或冰上進行。操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性。

5、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進行培養(yǎng)。大概10-14天，多數類器官直徑在200um-500um，可進行傳代操作。

6、腦類器官鑒定圖

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