腺病毒載體調(diào)控乳鐵蛋白抑制宮頸癌干細(xì)胞增殖機(jī)制研究

摘要

腺病毒載體介導(dǎo)的乳鐵蛋白（LF）過表達(dá)對宮頸癌干細(xì)胞（CCSCs）增殖的抑制作用及分子機(jī)制。通過構(gòu)建Ad5-LF腺病毒載體并轉(zhuǎn)染CCSCs，利用Western blot、qPCR及功能實驗驗證LF表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果顯示，LF過表達(dá)顯著抑制CCSCs增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制與Wnt/β-catenin通路抑制相關(guān)。本研究為靶向?qū)m頸癌干細(xì)胞的基因治療提供理論依據(jù)。

引言

宮頸癌是全球女性常見惡性腫瘤之一，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與宮頸癌干細(xì)胞（CCSCs）的耐藥性和自我更新能力密切相關(guān)。乳鐵蛋白（LF）是一種多功能糖蛋白，既往研究表明其在乳腺癌、結(jié)腸癌中具有抑癌作用，但其對CCSCs的調(diào)控機(jī)制尚未明確。腺病毒載體因其高效轉(zhuǎn)染能力和低整合風(fēng)險，成為基因治療的重要工具。

構(gòu)建攜帶LF基因的腺病毒載體（Ad5-LF），探究LF過表達(dá)對CCSCs增殖、凋亡及干性特征的影響，并深入解析其作用機(jī)制，旨在為宮頸癌靶向治療提供新策略。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分選

宮頸癌HeLa細(xì)胞系（某試劑細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)）經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)法富集CCSCs，通過流式細(xì)胞術(shù)（某品牌流式細(xì)胞儀）分選CD44+/CD24-亞群，并驗證其干性標(biāo)志物（Oct4、Nanog）表達(dá)。

1.2 腺病毒載體構(gòu)建

采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建Ad5-LF載體：將人LF cDNA克隆至pShuttle-CMV載體，經(jīng)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化至BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞（某試劑轉(zhuǎn)染試劑）包裝病毒顆粒，經(jīng)氯化銫梯度離心純化，測定病毒滴度（TCID50法）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

CCSCs分為三組：

Ad5-LF組：感染Ad5-LF（MOI=50）

Ad5-NC組：感染空載體腺病毒

Control組：未處理組

轉(zhuǎn)染后48小時收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 分子生物學(xué)檢測

qPCR：采用某試劑RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑，檢測LF mRNA表達(dá)（引物序列：F:5'-ATGCCAAACCGTTGACTTC-3', R:5'-TCAGTGGCAGGTAGTCCTT-3'）。

Western blot：檢測LF、β-catenin、Cyclin D1、Bax蛋白表達(dá)（某品牌成像系統(tǒng)分析）。

1.5 功能實驗

CCK-8實驗：檢測細(xì)胞增殖（某品牌酶標(biāo)儀讀取OD值）。

流式細(xì)胞術(shù)：Annexin V/PI雙染法分析凋亡率。

Transwell實驗：評估細(xì)胞遷移及侵襲能力（某品牌小室系統(tǒng)）。

1.6 機(jī)制研究

采用威尼德分子雜交儀進(jìn)行RNA-seq分析差異基因，并通過TCF/LEF熒光素酶報告基因檢測Wnt通路活性。

2. 結(jié)果

2.1  LF過表達(dá)抑制CCSCs增殖

Ad5-LF組LF mRNA及蛋白表達(dá)較對照組升高4.2倍（p<0.01）。

CCK-8顯示Ad5-LF組細(xì)胞活力下降58%（72小時），克隆形成率減少72%（p<0.001）。

2.2 LF誘導(dǎo)凋亡并抑制干性特征

流式結(jié)果顯示Ad5-LF組凋亡率增加3.5倍（p<0.01）。

干性標(biāo)志物Oct4、Nanog mRNA表達(dá)分別降低65%和58%（p<0.05）。

2.3 LF通過抑制Wnt通路發(fā)揮功能

Western blot顯示β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax上調(diào)。

TCF/LEF熒光素酶活性下降62%（p<0.001）。

3. 討論

證實Ad5-LF可高效轉(zhuǎn)染CCSCs并顯著抑制其增殖，其機(jī)制與Wnt/β-catenin通路失活相關(guān)。乳鐵蛋白通過下調(diào)β-catenin核轉(zhuǎn)位，阻斷下游Cyclin D1等促增殖基因表達(dá)，同時激活促凋亡因子Bax，提示其雙途徑抑癌作用。此外，RNA-seq數(shù)據(jù)揭示LF可能通過調(diào)控干細(xì)胞相關(guān)信號網(wǎng)絡(luò)（如Notch、Hedgehog）協(xié)同抑制CCSCs干性。

4. 結(jié)論

腺病毒載體介導(dǎo)的乳鐵蛋白過表達(dá)可有效抑制宮頸癌干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其作用依賴于Wnt通路調(diào)控。本研究為基于LF的基因治療策略提供了實驗依據(jù)，未來需進(jìn)一步開展體內(nèi)實驗驗證其臨床應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. 重組腺病毒載體介導(dǎo)人乳鐵蛋白對宮頸癌干樣細(xì)胞增殖與凋亡的影響 [J] . 張霞 ,都治香 ,王娜 . 中國組織工程研究 . 2017,第013期

2. 重組腺病毒介導(dǎo)的S100A9基因表達(dá)對宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 [J] . 陳苗苗1 ,王穎1 ,張文文1 . 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 2017,第004期

3. 重組腺病毒介導(dǎo)的S100A9基因表達(dá)對宮頸鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 [J] . 陳苗苗 ,王穎 ,張文文 . 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報 . 2017,第004期

4. 重組腺病毒介導(dǎo)KDRP-CD/TK基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響 [J] . 蘇國強(qiáng) ,黃宗海 ,張思宇 . 腫瘤防治研究 . 2008,第003期

5. KDR介導(dǎo)的雙zisha基因重組腺病毒對ECV304細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期及凋亡的影響 [J] . 蘇國強(qiáng) ,黃宗海 ,俞金龍 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 2005,第005期