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靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司   2025年03月13日 14:52  

“本研究介紹了一種安全有效的頭頸癌（HNSCC）瘤內表皮生長因子受體（EGFR）靶向的CRISPR-脂質納米顆粒（LNP）遞送策略，用于共封裝CRISPR-Cas9信使核糖核酸（mRNA）和單導向核糖核酸（sgRNA），以實現SOX2基因的敲除。我們生成了功能性靶向LNPs（tLNPs），它們共封裝Cas9 mRNA與靶向SOX2的sgRNA，并涂覆有抗EGFR抗體。我們評估了它們在HNSCC癌細胞中的攝取和表達，以及體內外的治療效果。結果顯示，這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞，誘導持久的治療反應，為臨床上高復發(fā)率的實體瘤如HNSCC提供了一種有前景的治療方法。”




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實驗結果


1.1 sgRNA篩選與基因編輯效率：


在本研究中，我們針對SOX2基因設計了三種sgRNA（sgSOX2-A、-B、-C），并在具有不同頭頸癌原發(fā)起源的HNSCC細胞系（UMSCC-104和FADU）中進行了篩選。通過轉染Cas9蛋白和針對SOX2的sgRNA（形成核糖核蛋白/RNP復合物）后，比較基因編輯效率。
Sanger測序和ICE分析結果顯示，sgSOX2-A在UMSCC-104細胞系中實現了58%的體外基因編輯，在FADU細胞系中實現了40%的基因編輯。因此，sgSOX2-A被選為進一步體內和體外實驗的最佳導向RNA。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖一、sgRNA的體外篩選和細胞活性檢測


1.2 基因編輯對細胞活性的影響：


為了評估基因編輯對細胞活性的影響，我們對轉染了sgSOX2-RNP的UMSCC104和Fadu HN-SCC細胞進行了XTT增殖實驗。同時，使用Turbo-GFP和YAP1 sgRNA作為對照。YAP1是一個誘導癌癥干細胞特性的轉錄因子，在HNSCC中過表達，與SOX2類似，因此被用作高效和高表達編輯的對照。實驗結果表明，SOX2基因編輯顯著降低了HNSCC細胞的活性。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖二、基因編輯對細胞活性的影響和編輯效率評估


1.3 靶向LNP的表征與基因編輯效率：


我們成功制備了靶向LNPs（tLNPs），并通過透射電子顯微鏡進行了表征。結果顯示，tLNPs具有適當的直徑、多分散性指數（PDI）和ζ電位，表明其具有良好的穩(wěn)定性和分散性。為了確認tLNPs的基因編輯效率，我們進行了基因編輯分析。結果顯示，單次治療tLNPs后，SOX2位點實現了約17%的基因編輯。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖三、靶向LNP的理化性質評價和編輯效率評價


1.4 生物分布與安全性評估：


在體內實驗中，我們評估了tLNPs的生物分布。結果顯示，tLNPs能夠特異性地靶向HNSCC腫瘤，并實現高效的SOX2基因敲除。同時，我們分析了脾臟和肝臟細胞的基因編輯百分比，以確認是否存在脫靶編輯。結果顯示，未發(fā)現脫靶編輯。此外，我們還評估了tLNPs的免疫原性和毒性。結果顯示，SOX2-cLNPs無毒性或免疫原性。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖四、靶向LNP的體內攝取、分布和表達



1.5 靶向tLNPs在HNSCC小鼠模型中的治療效果：


為了探索靶向tLNPs在體內介導治療性基因編輯的能力，我們評估了其抑制HNSCC腫瘤生長的效果。我們使用異種移植HNSCC小鼠模型，通過瘤內注射靶向tLNPs。結果顯示，與未治療組相比，靶向tLNPs組實現了90%的腫瘤生長抑制和90%的生存率提高（>84天），且50%的小鼠腫瘤全部消失。這一結果表明，靶向tLNPs能夠高效、特異性地靶向HNSCC腫瘤，并實現持久的治療反應。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖五、靶向LNP的體內藥效評價

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討論


本研究成功開發(fā)了針對頭頸癌的EGFR靶向CRISPR-LNP遞送策略，實現了SOX2基因的敲除，并評估了其治療效果。結果顯示，這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞，誘導持久的治療反應。這一策略為臨床上高復發(fā)率的實體瘤如HNSCC提供了一種有前景的治療方法。

然而，本研究仍存在一些局限性。例如，盡管tLNPs在HNSCC癌細胞中表現出良好的治療效果，但其在其他類型癌癥中的適用性尚需進一步驗證。此外，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶效應也是一個需要關注的問題。在未來的研究中，我們將繼續(xù)優(yōu)化tLNPs的制備和遞送策略，以降低脫靶效應并提高治療效率。



03

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結論



本研究成功開發(fā)了針對頭頸癌的EGFR靶向CRISPR-LNP遞送策略，并評估了其治療效果。結果顯示，這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞并誘導持久的治療反應。這一策略為臨床上高復發(fā)率的實體瘤提供了一種有前景的治療方法，值得進一步研究和推廣。


參考文獻：Masarwy, Razan, et al. "Targeted CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles elicits therapeutic genome editing in Head and Neck Cancer." Advanced Science (2024): 2411032.



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