12個(gè)樣品硬性指標(biāo)！低容量檢測(cè)系統(tǒng)為何難達(dá)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)？?

在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域，美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）中的細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試章節(jié)，均對(duì)檢測(cè)流程制定了嚴(yán)格的控制方法，這對(duì)用于光度測(cè)試的系統(tǒng)容量提出了明確要求。同時(shí)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）關(guān)于鱟試劑（LAL）檢測(cè)的指導(dǎo)文件，也對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的運(yùn)行有著關(guān)鍵影響。本文將深入探討這些規(guī)定對(duì)低容量測(cè)試系統(tǒng)的具體影響。

一、系統(tǒng)測(cè)試容量規(guī)定

（一）藥典對(duì)樣品數(shù)量的硬性要求

藥典BET第1、2、3章針對(duì)不同類型測(cè)試，均明確規(guī)定最-低樣品數(shù)量為12個(gè)。無(wú)論測(cè)試是在微孔板孔、反應(yīng)管，還是其他用于將樣品引入讀數(shù)儀的通道中進(jìn)行，用于BET測(cè)試的儀器容量都必須至少達(dá)到12個(gè)樣品。這一規(guī)定確保了檢測(cè)過(guò)程的規(guī)范性和結(jié)果的可靠性。

（二）FDA指導(dǎo)文件的補(bǔ)充規(guī)定

FDA的指導(dǎo)文件同樣強(qiáng)調(diào)了樣品容量的重要性，并對(duì)歸檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用作出規(guī)定。存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線是預(yù)先確定的參數(shù)組，用于確定標(biāo)準(zhǔn)線以測(cè)定內(nèi)毒素濃度。不過(guò)在使用存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線前，測(cè)試實(shí)驗(yàn)室必須證明標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性，且一致性需由使用者自行證明。此外，即便使用存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線，也需保證12個(gè)樣品的容量以測(cè)試完整標(biāo)準(zhǔn)系列。

同時(shí)，測(cè)試中應(yīng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)（陽(yáng)性）對(duì)照來(lái)驗(yàn)證已存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效性，同時(shí)還需包含陰性對(duì)照、樣品對(duì)照和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照，且所有對(duì)照均為一式兩份。如此一來(lái)，使用已存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)至少要能容納八個(gè)樣品。并且，已歸檔標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的前提是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品定量結(jié)果在已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的±25%范圍內(nèi)，這對(duì)測(cè)試重復(fù)性要求極-高，實(shí)際操作中可能較難實(shí)現(xiàn)。一旦無(wú)法恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)試就會(huì)無(wú)效，必須重新進(jìn)行。

值得注意的是，指導(dǎo)文件僅在“常規(guī)測(cè)試”部分允許使用存檔曲線。在驗(yàn)證試劑性能或進(jìn)行干擾因素測(cè)試（抑制/增強(qiáng)測(cè)試）時(shí)，測(cè)試必須包含完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同樣至少需要12個(gè)樣品。

二、藥典內(nèi)毒素檢測(cè)的具體要求

2001年協(xié)調(diào)一致的USP、EP和JP，在內(nèi)毒素檢測(cè)章節(jié)對(duì)檢測(cè)流程提出嚴(yán)格要求。所有檢測(cè)必須設(shè)置陰性對(duì)照和一系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，且相關(guān)檢測(cè)步驟需重復(fù)操作。陰性對(duì)照用于驗(yàn)證測(cè)試系統(tǒng)在無(wú)內(nèi)毒素干擾時(shí)不會(huì)誤判，確認(rèn)試劑無(wú)污染；標(biāo)準(zhǔn)系列至少涵蓋三種已知濃度的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)（RSE），通過(guò)分析每種已知標(biāo)準(zhǔn)濃度引發(fā)的反應(yīng)，結(jié)合系統(tǒng)輸出的光密度或起始時(shí)間等數(shù)據(jù)，通常采用數(shù)學(xué)方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)線，這條標(biāo)準(zhǔn)線是量化樣品內(nèi)毒素濃度的關(guān)鍵依據(jù)，用于衡量樣品相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素含量。

此外，無(wú)論是干擾因素檢測(cè)，還是常規(guī)檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)樣品都需要額外設(shè)置陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照（PPC）。該對(duì)照由添加到樣品中的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素構(gòu)成，只有當(dāng)PPC中測(cè)得的內(nèi)毒素濃度處于已知濃度的50-200%范圍內(nèi)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果才有效。若超出此范圍，則表明樣品對(duì)檢測(cè)過(guò)程存在干擾，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，需重新進(jìn)行檢測(cè)。由此可見(jiàn)，缺少任何一項(xiàng)指-定對(duì)照，內(nèi)毒素檢測(cè)都無(wú)法達(dá)到藥典要求。

藥典內(nèi)毒素檢測(cè)章節(jié)介紹了三種類型的檢測(cè)，其中兩種屬于預(yù)備檢測(cè)，第三種才是正式的測(cè)試，其具體操作在“光度法的三種測(cè)試類型”標(biāo)題下詳細(xì)說(shuō)明，表1對(duì)這三種類型的測(cè)試進(jìn)行了全面概述。

三、關(guān)于存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線和低容量測(cè)試系統(tǒng)需要考慮的問(wèn)題

1.在無(wú)法按照USP/EP/JP標(biāo)準(zhǔn)復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)曲線的低容量測(cè)試系統(tǒng)中，能否驗(yàn)證LAL試劑批次的性能？

2.是否可以使用已存檔的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行干擾因素測(cè)試，以根據(jù)USP/EP/JP要求驗(yàn)證方法？

3.是否可以使用已存檔的標(biāo)準(zhǔn)曲線按照USP/EP/JP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行常規(guī)內(nèi)毒素檢測(cè)？

4.在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和陰性對(duì)照的情況下，能否根據(jù)FDA指導(dǎo)文件使用存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行常規(guī)內(nèi)毒素測(cè)試？

5.能否在低容量測(cè)試系統(tǒng)中進(jìn)行一系列測(cè)試，以滿足檢測(cè)樣品、PPC以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照的要求？

6.能否驗(yàn)證存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度和精確度？

四、結(jié)論：明確系統(tǒng)容量標(biāo)準(zhǔn)

綜上所述，用于光度法測(cè)試的系統(tǒng)若不能至少容納12個(gè)樣品，就無(wú)法嚴(yán)格符合藥典細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試章節(jié)的要求。1991年FDA指南文件同樣對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)提出至少容納12個(gè)樣品的要求。低容量測(cè)試系統(tǒng)在滿足藥典及FDA指導(dǎo)文件規(guī)定的控制要求方面存在顯著困難，關(guān)于存檔標(biāo)準(zhǔn)曲線和低容量測(cè)試系統(tǒng)的諸多問(wèn)題，仍需進(jìn)一步深入研究與探討。