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mRNA-LNP轉染造血干細胞治療Fanconi貧血的研究

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司   2025年04月28日 13:24  

Fanconi貧血（FA）是一種遺傳性血液疾病，由22個已知基因的突變引起，這些基因編碼的FA蛋白在DNA交聯修復中起關鍵作用。FA患者常表現為造血干細胞（HSCs）迅速耗竭和骨髓衰竭。目前，主要的治愈方法是同種異體骨髓移植，但存在供體匹配困難和移植相關風險等問題。因此，基因修復或添加療法成為有吸引力的替代方案。

現有基因療法主要集中于體外修飾HSCs后回輸患者體內，但這種方法存在HSCs動員困難、體外傳代過程中存活率低以及對傳統預處理策略敏感等問題。本研究提出了一種新的體內蛋白替代療法，即通過LNPs遞送mRNA至體內，實現FA蛋白的體內表達，從而恢復HSPC功能。


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材料與方法


1.1 材料：

    • 實驗動物：Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）及野生型（WT）小鼠，購自Jackson Laboratory。

    • LNPs：由Acuitas Therapeutics提供，包含可離子化陽離子脂質、磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇（PEG）脂質。

    • mRNA：線性或環(huán)狀Fancc mRNA，通過體外轉錄合成，并進行5'帽結構和3'多聚腺苷酸尾修飾。


    1.2 方法：

      1. LNP制備與表征：將mRNA與LNPs按一定比例混合，通過旋轉蒸發(fā)法制備LNP-mRNA復合物，并測定其粒徑、zeta電位和RNA包封率。

      2. 動物實驗：通過靜脈注射（IV）或股骨內注射（IF）將LNP-mRNA復合物遞送至小鼠體內。在不同時間點收集骨髓、脾臟和肝臟等組織，評估m(xù)RNA的轉染效率和表達水平。

      3. 功能驗證：通過集落形成實驗評估LNP-mRNA處理對Fancc缺陷HSPCs增殖能力和烷基化劑抵抗性的影響。同時，通過流式細胞術分析HSPCs的免疫表型變化。


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      實驗結果


      2.1 增殖能力恢復：

      通過集落形成實驗評估了LNP-Fancc處理對Fancc缺陷HSPCs增殖能力的影響。結果顯示，LNP-Fancc處理顯著增加了Fancc缺陷HSPCs形成的集落數量（圖1A-C, D-F）。這表明LNP-Fancc處理能夠有效恢復Fancc缺陷HSPCs的增殖能力。


      2.2 烷基化劑抵抗性恢復：

      Fancc蛋白在DNA交聯修復中起關鍵作用，因此Fancc缺陷細胞對烷基化劑（如DNA交聯劑）高度敏感。本研究通過評估LNP-Fancc處理對Fancc缺陷HSPCs烷基化劑抵抗性的影響，進一步驗證了LNP-Fancc的功能恢復效果。

      結果顯示，LNP-Fancc處理顯著提高了Fancc缺陷HSPCs對MMC的抵抗性（圖1B-C, E-F）。這表明LNP-Fancc處理能夠有效恢復Fancc缺陷HSPCs的DNA修復能力，從而增強其對烷基化劑的抵抗性。


      圖片
      Figure 1. In vitro delivery of FANCC LNPs to correct FA-deficient BM-derived HSPCs


      2.3 遞送效率比較：

      本研究通過靜脈注射（IV）和股骨內注射（IF）兩種途徑將LNP-mRNA復合物遞送至Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）體內。結果顯示，無論采用哪種注射方式，LNP-mRNA均能有效轉染至小鼠骨髓（BM）細胞。相比IV注射，IF注射在骨髓中的轉染效率更高。具體來說，IF注射后，注射側股骨中LNP標記的細胞比例顯著高于未注射側股骨及脾臟等系統性分布組織（圖2D-F）。這一結果表明，直接注射至骨髓腔能夠更有效地將LNP-mRNA遞送至目標細胞。



      圖片
      Figure 2. IF delivery of Cre-recombinase LNP to stably induce reporter expression

      2.4 mRNA表達水平評估：


      使用熒光報告基因mCherry和熒光素酶報告系統評估了mRNA在體內的表達水平。結果顯示，IF注射后骨髓中mCherry的陽性細胞比例和平均熒光強度（MFI）均顯著高于IV注射（圖3A-D）。


      圖片
      Figure 3. IF vs. IV delivery of fluorescent reporter LNP


      熒光素酶報告系統進一步證實了這一結果。IF注射后，注射側股骨的熒光素酶活性顯著高于未注射側股骨及脾臟等組織（圖4A-B, E-H）。這些結果表明，IF注射能夠更有效地實現mRNA在骨髓中的表達。



      圖片
      Figure 4. In vivo LNPLFluc expression after IF or IV delivery



      2.5 mRNA表達壽命分析：
      為了評估m(xù)RNA在體內的表達壽命，本研究比較了線性mRNA和環(huán)狀mRNA在骨髓細胞中的表達情況。結果顯示，環(huán)狀mRNA的表達壽命顯著長于線性mRNA（圖5E-F）。在體外實驗中，使用熒光素酶報告系統監(jiān)測了LNP-Fancc處理后的Fancc缺陷造血干祖細胞（HSPCs）中Fancc mRNA的表達壽命。結果顯示，環(huán)狀mRNA處理組細胞的熒光素酶活性在較長時間內保持較高水平（圖5G-H），表明環(huán)狀mRNA能夠更有效地延長mRNA在體內的表達壽命。

      圖片
      Figure 5. Functional lifetime of LNP mRNAs

      2.6 免疫原性分析：
      通過定量實時PCR分析了LNP處理對Fancc缺陷HSPCs免疫基因表達的影響。結果顯示，盡管部分免疫相關基因的表達水平有所變化，但這些變化并未達到統計學顯著性（圖6A-B）。這表明LNP處理未引起顯著的免疫原性反應，為LNP-mRNA療法的臨床應用提供了重要的安全性依據。

      圖片
      Figure 6. Immune screening of HSPCs after LNP treatment


      2.7 重復給藥效果：
      為了評估重復給藥對Fancc缺陷HSPCs功能恢復的影響，本研究在體外實驗中進行了多次LNP-Fancc處理。結果顯示，多次LNP-Fancc處理能夠進一步提高Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化劑抵抗性（圖7A-C）。

      圖片
      Figure 7. Impact of LNPCFancc on Fancc–/– HSPC in vitro proliferation and engraftment potential


      綜上所述，本研究通過LNPs遞送mRNA至Fancc缺陷小鼠體內，成功實現了Fancc蛋白的體內表達，并顯著恢復了Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化劑抵抗性。同時，LNP處理未引起顯著的免疫原性反應，為FA的臨床治療提供了新的策略



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      討論


      本研究通過LNPs遞送Fancc mRNA至Fancc缺陷小鼠體內，成功恢復了HSPCs的功能。這種體內蛋白替代療法為FA的臨床治療提供了新的策略。與體外基因療法相比，體內遞送mRNA具有操作簡便、無需復雜基礎設施和物流支持等優(yōu)勢。

      然而，本研究仍存在一些局限性。首先，Fancc缺陷小鼠模型并未自然呈現骨髓衰竭表型，這限制了模型對FA病理生理過程的模擬能力。其次，mRNA的表達具有瞬時性，需要重復給藥以實現持久療效。未來的研究將探索更穩(wěn)定的mRNA修飾策略以及優(yōu)化給藥方案以提高療效。



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      結論



      本研究通過LNPs遞送mRNA成功恢復了Fancc缺陷小鼠HSPCs的功能，為FA的臨床治療提供了新的策略。未來的研究將進一步優(yōu)化mRNA修飾策略、給藥方案以及評估該療法的長期療效和安全性。


      參考文獻：Banda, O., Adams, S. E., Omer, L., Jung, S. K., Said, H., Phoka, T., ... & Kurre, P. (2025). Restoring hematopoietic stem and progenitor cell function in Fancc mice by in situ delivery of RNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy: Nucleic Acids, 36, 1-12.

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