干貨分享 | 實(shí)驗(yàn)室常用蛋白檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)室超常用的蛋白濃度測(cè)定方法，看這一篇就夠了！選對(duì)方法，實(shí)驗(yàn)效率倍增！

Part1 紫外吸收法(A280法)

蛋白質(zhì)中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基在280nm附近有紫外吸收峰。通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 處的吸光度值，可以估算蛋白質(zhì)濃度?；贐eer-Lambert定律：A=εbc，其中A是吸光度，ε是摩爾消光系數(shù)，b是光程，c是濃度。對(duì)于蛋白質(zhì)，ε和b在特定條件下可以視為常數(shù)，因此吸光度A與濃度c成正比。通常假設(shè)蛋白質(zhì)的平均消光系數(shù)ε約為1.0(mg/mL)^-1 cm^-1。

The merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

快速簡(jiǎn)便

操作非常簡(jiǎn)單快捷，只需使用紫外分光光度計(jì)直接讀取280nm處的吸光度即可。

非破壞性

樣品可以回收，因?yàn)闇y(cè)量過(guò)程中樣品沒(méi)有被化學(xué)修飾或消耗。

不需要試劑

除了緩沖液，不需要額外的化學(xué)試劑。

不需要試劑

除了緩沖液，不需要額外的化學(xué)試劑。

靈敏度較高

比紫外吸收法和 Bradford 法更靈敏，可以檢測(cè)更低濃度的蛋白質(zhì)。

受蛋白質(zhì)組成影響相對(duì)較小

因?yàn)槭腔陔逆I反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響比 Bradford 法小一些。

demerits of this method  缺點(diǎn)

操作步驟繁瑣

需要多個(gè)試劑，操作步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)。

試劑不穩(wěn)定

Folin-Ciocalteu 試劑不穩(wěn)定，容易受還原性物質(zhì)污染，需要臨用前配制。

干擾多

容易受到多種化學(xué)物質(zhì)的干擾，包括一些緩沖液成分（如Tris，EDTA），以及非離子型去垢劑、還原劑等。需要嚴(yán)格控制樣品和試劑的純度。

時(shí)間依賴性

顯色反應(yīng)需要精確控制反應(yīng)時(shí)間和溫度，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

同樣需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Part4 BCA法

BCA法原理與Lowry法類似，也是基于兩個(gè)步驟的反應(yīng)。第一步是蛋白質(zhì)中的肽鍵將銅離子 在堿性條件下還原為亞銅離子 。第二步是亞銅離子與 BCA試劑(二喹啉甲酸)反應(yīng)，形成紫色的 BCA-Cu*復(fù)合物，該復(fù)合物在 562nm 處有最大吸收。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高

與 Lowry 法靈敏度相當(dāng)，比 Bradford 法和紫外吸收法高。

操作相對(duì)簡(jiǎn)便

試劑相對(duì)穩(wěn)定，通常試劑以預(yù)混形式提供，操作步驟比Lowry 法簡(jiǎn)化。

受去垢劑干擾小

相對(duì)于 Lowry 法，受一些去垢劑(如 SDS,Triton X-100)的干擾較小，更適用于含有去垢劑的樣品。

線性范圍較寬

BCA法的線性范圍比 Bradford 法寬。

穩(wěn)定性好

顯色后的復(fù)合物比 Bradford 法更穩(wěn)定，可以放置較長(zhǎng)時(shí)間再讀取數(shù)據(jù)。

demerits of this method  缺點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

銅離子還原反應(yīng)

基于銅離子還原反應(yīng)，容易受到還原性物質(zhì)的干擾。

時(shí)間和溫度依賴性

反應(yīng)需要加熱孵育，結(jié)果受時(shí)間和溫度影響。

對(duì)脂類物質(zhì)敏感

脂類物質(zhì)會(huì)干擾 BCA反應(yīng)。

Part5 雙縮脲法

雙縮脲法是最早用于蛋白質(zhì)定量的方法之一。在強(qiáng)堿性條件下，含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物(包括蛋白質(zhì))可以與銅離子反應(yīng)，形成紫紅色的絡(luò)合物。這種絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)在540nm左右。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

受蛋白質(zhì)組成影響最小

因?yàn)槭侵苯优c肽鍵反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成差異的影響最小，對(duì)不同蛋白質(zhì)的定量相對(duì)比較準(zhǔn)確。

干擾少

受樣品中常見(jiàn)的鹽、緩沖液、以及一些小分子物質(zhì)的干擾較小。

demerits of this method  缺點(diǎn)

靈敏度低

相對(duì)于 Bradford法、Lowry法和BCA法，靈敏度低，通常只能用于測(cè)定較高濃度的蛋白質(zhì)(>1mg/mL)。

需要大量樣品

由于靈敏度低，需要較高濃度的蛋白質(zhì)樣品和較大量樣品才能獲得可讀的吸光度值。

操作步驟較多

需要配置試劑，操作步驟相對(duì)繁瑣。

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Part6 相關(guān)耗材推薦

在實(shí)驗(yàn)室蛋白檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)耗材的品質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性有著重要影響。愛(ài)津生物扎根生命科學(xué)領(lǐng)域，憑借多年積累的技術(shù)與持續(xù)創(chuàng)新，擁有一系列適配蛋白檢測(cè)的耗材，包含普通吸頭（低吸附款）、酶標(biāo)板、微量離心管、常規(guī)離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等。

Company Profile

關(guān) 于 愛(ài) 津

愛(ài)津生物，成立于2009年

致力于研發(fā)生產(chǎn)生物科研領(lǐng)域所需的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品

專注生命科學(xué)、生物工程技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室耗材

堅(jiān)持不斷優(yōu)化、品質(zhì)至上的原則，將更值得信賴的產(chǎn)品交付于您
……

選擇愛(ài)津，選擇品質(zhì)