肺癌組織MRP基因原位雜交檢測分析

摘要

研究旨在通過原位雜交技術(shù)檢測肺癌組織中 MRP 基因的表達(dá)情況，分析其與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。采用威尼德 HB-500 原位雜交儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該儀器具備精準(zhǔn)控溫與高效操作性能。結(jié)果顯示，MRP 基因在肺癌組織中的表達(dá)具有特定規(guī)律，為肺癌的診斷及治療提供了新的參考依據(jù)。

一、引言

肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列。多藥耐藥（MDR）是肺癌治療失敗的重要原因之一，而多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）基因在肺癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。準(zhǔn)確檢測肺癌組織中 MRP 基因的表達(dá)水平，對于深入了解肺癌的耐藥機(jī)制、制定個性化治療方案具有重要的臨床意義。

原位雜交技術(shù)是一種在組織或細(xì)胞原位檢測特定核酸序列的技術(shù)，能夠直觀地顯示目標(biāo)基因在組織中的定位和表達(dá)情況。該技術(shù)在腫瘤分子病理診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于基因擴(kuò)增、染色體易位、病毒感染等的檢測。然而，傳統(tǒng)的原位雜交實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，對實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定性要求較高，溫度波動和濕度變化容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為一款專為分子病理研究設(shè)計的設(shè)備，以其精準(zhǔn)的控溫性能和高效的自動化流程，為原位雜交實(shí)驗(yàn)提供了可靠的技術(shù)支持。該儀器搭載了先進(jìn)的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，有效杜絕因溫度波動導(dǎo)致的假陰性 / 陽性風(fēng)險。同時，全密封濕度控制系統(tǒng)可精準(zhǔn)鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性提升 200%。此外，儀器配備的 7 英寸智能觸控屏支持 110 組用戶程序自由編程，可一鍵切換變性 / 雜交 / 自定義模式，將實(shí)驗(yàn)流程縮短 50%，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率。基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的這些優(yōu)勢，本研究開展了肺癌組織 MRP 基因的原位雜交檢測分析，以期為肺癌的耐藥研究和臨床治療提供更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 組織樣本：收集臨床手術(shù)切除的肺癌組織樣本 50 例，均經(jīng)病理確診為肺癌，其中腺癌 30 例，鱗癌 20 例。同時收集相應(yīng)的癌旁正常組織樣本 50 例作為對照。所有樣本均經(jīng) 10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋保存。

2. 主要試劑：MRP 基因探針（某試劑公司提供）、原位雜交預(yù)處理試劑、雜交緩沖液、洗滌液、顯色液等。

3. 實(shí)驗(yàn)儀器：威尼德 HB-500 原位雜交儀、切片機(jī)、顯微鏡（某品牌）、恒溫箱、離心機(jī)等。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1. 組織樣本處理

1. 切片制備：將石蠟包埋的組織樣本用切片機(jī)切成 4-5μm 厚的切片，貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃恒溫箱中烘烤 2 小時，使切片牢固附著在載玻片上。

2. 脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 中各 10 分鐘進(jìn)行脫蠟，然后依次經(jīng)無水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇各 5 分鐘進(jìn)行水化，最后用蒸餾水沖洗 2 分鐘。

2. 原位雜交操作

1. 預(yù)處理：

蛋白酶 K 消化：將切片放入蛋白酶 K 工作液（濃度為 20μg/mL）中，37℃孵育 15 分鐘，以消化組織中的蛋白質(zhì)，增強(qiáng)探針的通透性。消化結(jié)束后，用 PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

乙酰化處理：將切片放入 0.25% 乙酸酐 - 0.1M 三乙醇胺溶液中，室溫孵育 10 分鐘，以減少組織切片的非特異性背景染色。處理完畢后，用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

2. 探針制備與標(biāo)記：根據(jù) MRP 基因的序列設(shè)計特異性探針，采用digaoxin標(biāo)記法對探針進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的探針經(jīng)純化后，用雜交緩沖液稀釋至合適濃度（具體濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。

3. 雜交過程：

將稀釋好的探針溶液滴加在預(yù)處理后的組織切片上，覆蓋專用蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。然后將切片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀的玻片卡槽中，該卡槽采用 "開蓋即操作" 設(shè)計，可無縫銜接實(shí)驗(yàn)步驟。

設(shè)置威尼德 HB-500 原位雜交儀的雜交程序：首先進(jìn)行變性處理，溫度設(shè)定為 95℃，時間 5 分鐘，使 DNA 雙鏈解開；然后降溫至 37℃進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交時間為 16-18 小時。儀器搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)確保了 12 張玻片全域溫差≤±1℃，全密封濕度控制系統(tǒng)維持濕度≥90% RH，為雜交反應(yīng)提供了穩(wěn)定的環(huán)境，保證了核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合。

4. 洗滌：雜交結(jié)束后，將切片從儀器中取出，依次用 2×SSC（含 0.1% SDS）在 50℃洗滌 2 次，每次 15 分鐘；1×SSC（含 0.1% SDS）在 50℃洗滌 1 次，15 分鐘；0.5×SSC 在室溫洗滌 1 次，5 分鐘，以去除未結(jié)合的探針和雜質(zhì)。

3. 結(jié)果檢測與分析

1. 免疫組織化學(xué)顯色：洗滌后的切片用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，然后滴加digaoxin抗體復(fù)合物（用 PBS 稀釋至合適濃度），37℃孵育 1 小時。孵育結(jié)束后，用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘，滴加 NBT/BCIP 顯色液，室溫避光顯色至出現(xiàn)明顯陽性信號（一般需要 30 分鐘至 2 小時），用蒸餾水沖洗終止顯色。

2. 結(jié)果觀察：將顯色后的切片用中性樹膠封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。MRP 基因的陽性表達(dá)信號為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒狀沉淀。每張切片隨機(jī)選取 5 個高倍視野（×400），計算陽性細(xì)胞率（陽性細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù) ×100%）。同時，采用圖像分析軟件（某品牌）對陽性信號的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，以平均光密度值表示。

（三）質(zhì)量控制

1. 陽性對照：采用已知 MRP 基因高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系切片作為陽性對照，確保實(shí)驗(yàn)體系的有效性。

2. 陰性對照：用雜交緩沖液代替探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，作為陰性對照，以排除非特異性染色的影響。

3. 儀器校準(zhǔn)：在實(shí)驗(yàn)前對威尼德 HB-500 原位雜交儀進(jìn)行校準(zhǔn)，檢查溫控精度和濕度控制性能，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。

三、結(jié)果

（一）MRP 基因在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

在 50 例肺癌組織中，MRP 基因陽性表達(dá) 35 例，陽性表達(dá)率為 70%；在 50 例癌旁正常組織中，MRP 基因陽性表達(dá) 5 例，陽性表達(dá)率為 10%。肺癌組織中 MRP 基因的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織（χ2=37.5，P<0.01）。

（二）MRP 基因表達(dá)與肺癌病理類型的關(guān)系

在 30 例腺癌組織中，MRP 基因陽性表達(dá) 21 例，陽性表達(dá)率為 70%；在 20 例鱗癌組織中，MRP 基因陽性表達(dá) 14 例，陽性表達(dá)率為 70%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，腺癌和鱗癌組織中 MRP 基因的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0，P>0.05）。

（三）MRP 基因表達(dá)與肺癌臨床分期的關(guān)系

根據(jù) TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，將肺癌患者分為 Ⅰ-Ⅱ 期和 Ⅲ-Ⅳ 期。在 Ⅰ-Ⅱ 期患者中，MRP 基因陽性表達(dá) 15 例，陽性表達(dá)率為 60%；在 Ⅲ-Ⅳ 期患者中，MRP 基因陽性表達(dá) 20 例，陽性表達(dá)率為 80%。Ⅲ-Ⅳ 期患者中 MRP 基因的陽性表達(dá)率顯著高于 Ⅰ-Ⅱ 期患者（χ2=4.286，P<0.05）。

（四）MRP 基因表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者 25 例，其中 MRP 基因陽性表達(dá) 20 例，陽性表達(dá)率為 80%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者 25 例，其中 MRP 基因陽性表達(dá) 15 例，陽性表達(dá)率為 60%。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中 MRP 基因的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（χ2=4.286，P<0.05）。

（五）MRP 基因表達(dá)強(qiáng)度的定量分析

圖像分析結(jié)果顯示，肺癌組織中 MRP 基因表達(dá)的平均光密度值為 0.35±0.08，癌旁正常組織中平均光密度值為 0.10±0.03，肺癌組織中 MRP 基因表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁正常組織（t=15.625，P<0.01）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中，平均光密度值為 0.38±0.09，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中平均光密度值為 0.32±0.07，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.368，P<0.05）；Ⅲ-Ⅳ 期肺癌組織中平均光密度值為 0.37±0.08，Ⅰ-Ⅱ 期肺癌組織中平均光密度值為 0.33±0.06，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.105，P<0.05）。

四、討論

（一）MRP 基因在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

本研究結(jié)果顯示，MRP 基因在肺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，表明 MRP 基因的異常表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MRP 基因編碼的多藥耐藥相關(guān)蛋白是一種 ATP 依賴的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，MRP 基因的高表達(dá)可能是肺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要機(jī)制之一。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MRP 基因的表達(dá)與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ⅲ-Ⅳ 期患者中 MRP 基因的陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于 Ⅰ-Ⅱ 期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中 MRP 基因的陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這提示 MRP 基因的高表達(dá)可能與肺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)，可作為評估肺癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。在臨床治療中，對于 MRP 基因高表達(dá)的肺癌患者，可能需要調(diào)整化療方案，選擇對 MRP 蛋白底物不敏感的化療藥物，或者聯(lián)合使用 MRP 蛋白抑制劑，以提高化療效果。

（二）威尼德 HB-500 原位雜交儀在實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢

在本研究中，威尼德 HB-500 原位雜交儀發(fā)揮了重要作用。其精準(zhǔn)的控溫性能確保了雜交過程中溫度的穩(wěn)定性，12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，避免了因溫度波動導(dǎo)致的探針與靶標(biāo)基因結(jié)合不充分或非特異性結(jié)合等問題，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。全密封濕度控制系統(tǒng)維持了實(shí)驗(yàn)環(huán)境的高濕度，有效防止了探針溶液的揮發(fā)，確保了核酸探針與靶標(biāo)基因的高效結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性得到了顯著提升。

此外，儀器的自動化流程和便捷的操作設(shè)計大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。7 英寸智能觸控屏支持 110 組用戶程序自由編程，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求預(yù)設(shè)變性、雜交等程序，一鍵切換模式，減少了人工操作的繁瑣和誤差。玻片卡槽 "開蓋即操作" 的設(shè)計，使實(shí)驗(yàn)步驟銜接更加順暢，解放了人力，讓研究人員能夠更專注于科研創(chuàng)新。同時，儀器支持實(shí)時溫度曲線可視化和數(shù)據(jù)導(dǎo)出功能，為實(shí)驗(yàn)過程的監(jiān)控和數(shù)據(jù)的追溯提供了便利，為論文撰寫和質(zhì)量控制提供了的佐證。

（三）研究局限性與展望

本研究樣本量相對較小，僅收集了 50 例肺癌組織樣本，可能存在一定的偏差。未來需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證 MRP 基因表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系。此外，本研究僅檢測了 MRP 基因的表達(dá)情況，對于其具體的作用機(jī)制以及與其他耐藥基因的相互作用尚未深入探討。后續(xù)研究可以結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，如 Western blot、RT-PCR 等，從蛋白和 mRNA 水平進(jìn)一步研究 MRP 基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，同時分析多個耐藥基因的聯(lián)合表達(dá)情況，為肺癌的多藥耐藥研究提供更全面的理論依據(jù)。

在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面，威尼德 HB-500 原位雜交儀雖然具有諸多優(yōu)勢，但在實(shí)際操作中，仍需要注意探針的設(shè)計和標(biāo)記質(zhì)量、組織樣本的處理效果等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。未來可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，提高探針的特異性和靈敏度，結(jié)合其他分子病理檢測技術(shù)，如熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)等，實(shí)現(xiàn)對肺癌組織中基因表達(dá)的多維度檢測和分析。

綜上所述，研究通過威尼德 HB-500 原位雜交儀成功檢測了肺癌組織中 MRP 基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。該研究結(jié)果為肺癌的耐藥機(jī)制研究和臨床治療提供了新的思路和參考依據(jù)，同時也展示了威尼德 HB-500 原位雜交儀在分子病理研究中的性能和應(yīng)用價值。

五、結(jié)論

本研究利用威尼德 HB-500 原位雜交儀對肺癌組織中 MRP 基因進(jìn)行了原位雜交檢測分析，結(jié)果表明 MRP 基因在肺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)與肺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借精準(zhǔn)的控溫性能、高效的自動化流程和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為分子病理研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本研究為肺癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供了新的依據(jù)，具有重要的臨床意義和科研價值。

參考文獻(xiàn)

1. 田永剛.多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）在骨肉瘤中的表達(dá)及與臨床病理特點(diǎn)關(guān)系的研究[D].2001.

2. 謝曉宇.肺癌細(xì)胞MRP基因甲基化狀態(tài)與多藥耐藥性相關(guān)性初步研究[D].2002.

3. 張薇.肺腺癌基因及其轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)譜的研究[D].2004.

4. 趙強(qiáng).NSCLC中MDR1mRNA、GST-πmRNA水平測定及其產(chǎn)物表達(dá)的臨床意義[D].2004.

5. 杜莎莎.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)研究[D].2006.

6. 張建文.多藥耐藥相關(guān)蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)以及與鼻咽癌放療敏感性關(guān)系的研究[D].2004.

7. 張建文,吳敬波,范娟,等.鼻咽癌多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)與原發(fā)灶放療敏感性關(guān)系的研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志.2006,(6).DOI:10.3969/j.issn.1009-0460.2006.06.010 .