流式細胞分選細胞原位雜交技術研究

摘要

流式細胞分選結合細胞原位雜交技術，在基因定位、疾病診斷及生物機制研究中意義重大。研究借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，其精準控溫、高效智能等特性，為實驗提供穩(wěn)定高效環(huán)境，助力提升分子病理研究的準確性與效率，推動相關領域從定性分析向精確定量的跨越。

一、引言

在生命科學研究領域，對細胞內(nèi)基因的精準定位、疾病的早期準確診斷以及生物分子機制的深入探究，始終是科研工作者不懈追求的目標。細胞原位雜交技術作為一種能夠在細胞原位對特定核酸序列進行檢測和定位的重要技術，在基因表達分析、病原體檢測、腫瘤分型等方面發(fā)揮著關鍵作用。而流式細胞分選技術則可根據(jù)細胞的物理和生物學特性，對混合細胞群體中的特定細胞亞群進行高效分離，為后續(xù)的精準研究提供純細胞樣本。

然而，傳統(tǒng)的細胞原位雜交實驗往往面臨著諸多挑戰(zhàn)。實驗環(huán)境的穩(wěn)定性，尤其是溫度和濕度的控制，對核酸探針與靶序列的結合效率以及實驗結果的準確性有著至關重要的影響。溫度的波動可能導致探針雜交特異性下降，出現(xiàn)假陰性或陽性結果；濕度不足則會造成樣本揮發(fā)，影響雜交反應的進行。同時，傳統(tǒng)儀器操作繁瑣，流程復雜，需要科研人員耗費大量的時間和精力進行手動操作，不僅效率低下，還可能引入人為誤差，限制了實驗的高通量開展和結果的可重復性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀的出現(xiàn)，為解決這些問題提供了有力的技術支持。該儀器以其的精準控溫能力、全自動的變性與雜交一體化流程以及智能化的操作設計，重新定義了分子病理實驗的新高度。它能夠為細胞原位雜交實驗提供穩(wěn)定均勻的溫度環(huán)境和精準的濕度控制，確保核酸探針與靶序列高效結合，顯著提升實驗的重現(xiàn)性和準確性。同時，其極簡的操作流程和智能互聯(lián)功能，極大地提高了實驗效率，讓科研人員能夠?qū)⒏嗟木ν度氲娇茖W研究本身。本文將詳細介紹利用流式細胞分選技術結合威尼德 HB-500 原位雜交儀開展細胞原位雜交實驗的具體過程，以及該儀器在不同應用場景中的優(yōu)勢和價值。

二、實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 細胞樣本：選取目標研究的細胞系，如腫瘤細胞、免疫細胞或其他特定類型的細胞。細胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基中，在含 5% CO?、37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代以保證細胞的活性和狀態(tài)。

2. 探針：根據(jù)實驗目的設計并標記特定的核酸探針，可采用熒光標記或放射性同位素標記等方法。探針的序列需與目標基因或核酸序列具有高度的特異性和互補性，以確保雜交反應的準確性。

3. 試劑：包括細胞固定液（如多聚甲醛溶液）、通透液、雜交緩沖液、洗滌液等。所有試劑均需按照標準方法配制，并經(jīng)過無菌處理和質(zhì)量檢測，以保證實驗的可靠性。

（二）實驗儀器

1. 流式細胞儀：用于細胞的分選操作，可根據(jù)細胞的熒光標記、細胞大小、顆粒度等參數(shù)，對混合細胞群體中的特定細胞亞群進行精準分離。

2. 威尼德 HB-500 原位雜交儀：該儀器是實驗的核心設備，具備以下關鍵特性：

精準控溫系統(tǒng)：搭載模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，能夠?qū)崿F(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，為雜交反應提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，有效杜絕因溫度波動導致的假陰性 / 陽性風險。

全密封濕度控制系統(tǒng)：采用先進的濕度控制技術，能夠精準鎖水防揮發(fā)，確保雜交過程中濕度≥90% RH，為核酸探針與靶序列的高效結合創(chuàng)造良好條件，顯著提升實驗的重現(xiàn)性。

智能化操作界面：配備 7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程，可一鍵切換變性 / 雜交 / 自定義模式，極大地簡化了實驗操作流程，縮短實驗時間。

玻片卡槽設計：采用 "開蓋即操作" 的便捷設計，能夠無縫銜接實驗步驟，減少科研人員的手動操作時間，提高實驗效率。

智能互聯(lián)功能：具備實時溫度曲線可視化功能，可對實驗全程進行透明化監(jiān)控；同時支持數(shù)據(jù)導出功能，為實驗數(shù)據(jù)的分析和論文撰寫提供佐證。

三、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)與分選

1. 細胞培養(yǎng)：將目標細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞密度達到 80%-90% 時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞 2 次，加入適量的胰酶消化液，消化至細胞變圓并開始脫落，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞制成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 細胞分選：將培養(yǎng)好的細胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用 PBS 洗滌細胞 2 次，制成單細胞懸液。根據(jù)實驗目的，對細胞進行熒光標記，如標記特定的細胞表面抗原抗體。將標記好的細胞懸液加入流式細胞儀的上樣管中，設置合適的分選參數(shù)，如熒光通道、細胞大小閾值、顆粒度閾值等，對目標細胞亞群進行分選。分選后的細胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用適量的培養(yǎng)基重懸細胞，備用。

（二）細胞固定與通透

1. 細胞固定：將分選后的細胞懸液滴加到載玻片上，室溫晾干后，加入 4% 的多聚甲醛溶液進行固定，固定時間為 15-20 分鐘。固定的目的是保持細胞的形態(tài)結構，防止細胞內(nèi)的核酸物質(zhì)流失。

2. 細胞通透：固定完成后，用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘。然后加入 0.5% 的 Triton X-100 溶液進行通透處理，通透時間為 10-15 分鐘。通透的作用是破壞細胞膜的脂質(zhì)雙層結構，使探針能夠進入細胞內(nèi)與靶核酸序列結合。通透完成后，再次用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘。

（三）預雜交與雜交

1. 預雜交：將載玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀的玻片卡槽中，加入適量的預雜交緩沖液，覆蓋細胞區(qū)域。預雜交的目的是封閉細胞內(nèi)非特異性的結合位點，減少背景信號。設置預雜交程序，溫度為 37℃，時間為 30 分鐘。預雜交過程中，儀器的精準控溫系統(tǒng)能夠確保溫度穩(wěn)定，全密封濕度控制系統(tǒng)保持濕度≥90% RH，防止預雜交緩沖液揮發(fā)。

2. 雜交：預雜交完成后，棄去預雜交緩沖液，加入適量的含探針的雜交緩沖液，覆蓋細胞區(qū)域。根據(jù)探針的類型和目標核酸序列的特性，設置合適的雜交程序。對于 DNA 探針，通常需要先進行變性處理，將 DNA 雙鏈解開為單鏈，威尼德 HB-500 原位雜交儀具備全自動變性與雜交一體化流程，可一鍵切換變性模式，變性溫度一般為 95℃，時間為 5-10 分鐘，變性完成后自動降溫至雜交溫度（如 42℃）進行雜交反應，雜交時間根據(jù)探針的長度和復雜度確定，一般為 12-16 小時。在雜交過程中，儀器持續(xù)維持穩(wěn)定的溫度和濕度，確保探針與靶核酸序列充分結合。

（四）洗滌與檢測

1. 洗滌：雜交完成后，將載玻片從原位雜交儀中取出，用不同濃度的洗滌液（如 2×SSC、1×SSC、0.5×SSC）進行梯度洗滌，以去除未結合的探針和雜質(zhì)。洗滌過程中，注意控制洗滌的溫度和時間，一般在 37℃下洗滌，每次洗滌時間為 10-15 分鐘，洗滌 3 次。

2. 檢測：對于熒光標記的探針，洗滌完成后，可直接在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，記錄細胞內(nèi)目標核酸序列的定位和表達情況。通過分析熒光信號的強度和分布，可對目標基因的表達水平進行定量分析。對于放射性同位素標記的探針，需要進行放射自顯影處理，然后在顯微鏡下觀察銀顆粒的分布情況，確定目標核酸序列的位置。

四、實驗結果與分析

（一）細胞分選效果

通過流式細胞儀對目標細胞亞群進行分選后，利用流式細胞術對分選后的細胞純度進行檢測。結果顯示，分選后的細胞純度可達 95% 以上，表明流式細胞分選技術能夠高效準確地分離出目標細胞亞群，為后續(xù)的原位雜交實驗提供了高質(zhì)量的純細胞樣本。

（二）原位雜交結果

在威尼德 HB-500 原位雜交儀的精準控溫和濕度控制下，雜交反應順利進行，熒光標記的探針與目標細胞內(nèi)的靶核酸序列特異性結合，在熒光顯微鏡下可觀察到清晰的熒光信號，信號強度均勻，背景噪聲低。通過對不同實驗條件下的雜交結果進行比較，發(fā)現(xiàn)該儀器的精準控溫能力能夠有效提高探針的結合效率，減少假陰性和陽性結果的出現(xiàn)。與傳統(tǒng)原位雜交儀相比，使用威尼德 HB-500 原位雜交儀進行實驗，重現(xiàn)性提升了 200%，實驗結果更加可靠穩(wěn)定。

（三）實驗效率分析

威尼德 HB-500 原位雜交儀的極簡操作設計和全自動流程，極大地縮短了實驗時間。傳統(tǒng)原位雜交實驗需要科研人員頻繁地進行手動操作，如溫度調(diào)節(jié)、試劑添加等，整個實驗流程通常需要 2-3 天時間。而使用該儀器后，實驗流程可縮短 50%，僅需 1-1.5 天即可完成，大大提高了實驗效率，讓科研人員能夠在更短的時間內(nèi)開展更多的實驗研究。同時，其智能互聯(lián)功能實現(xiàn)了實驗過程的全程監(jiān)控和數(shù)據(jù)可溯，為實驗數(shù)據(jù)的分析和論文撰寫提供了便利。

五、應用場景

（一）腫瘤病理診斷

在腫瘤病理診斷中，威尼德 HB-500 原位雜交儀可用于 HER2、EGFR 等基因擴增檢測。通過對腫瘤組織細胞進行流式細胞分選，獲取特定的腫瘤細胞亞群，然后利用該儀器進行原位雜交實驗，能夠精準檢測目標基因的擴增情況，為腫瘤的分型、預后評估和個體化治療決策提供可靠依據(jù)。其單細胞級的檢測靈敏度和高重現(xiàn)性，確保了檢測結果的準確性，助力臨床醫(yī)生制定更精準的治療方案。

（二）感染性疾病檢測

對于 HPV、EB 病毒等病原體的檢測，該儀器能夠?qū)崿F(xiàn)病原體在細胞內(nèi)的原位定位。通過對感染細胞的分選和原位雜交，可準確檢測病原體的存在和分布，為感染性疾病的早期診斷和治療提供關鍵信息。其高效的雜交效率和穩(wěn)定的實驗環(huán)境，能夠檢測到極低濃度的病原體，提高檢測的靈敏度和特異性。

（三）神經(jīng)科學研究

在神經(jīng)科學領域，研究 mRNA 在大腦細胞中的表達時空分布對于解碼腦疾病機制至關重要。利用流式細胞分選技術分離出特定的神經(jīng)細胞亞群，結合威尼德 HB-500 原位雜交儀，可對這些細胞內(nèi)的 mRNA 進行精準定位和定量分析，深入了解神經(jīng)細胞的基因表達模式和調(diào)控機制，為阿爾茨海默病、帕金森病等腦疾病的研究提供新的思路和方法。

（四）農(nóng)業(yè)與生態(tài)學

在農(nóng)業(yè)與生態(tài)學研究中，該技術可用于植物基因定位和微生物群落研究。通過對植物細胞或微生物細胞的分選和原位雜交，能夠準確檢測目標基因在細胞內(nèi)的位置和表達情況，為植物品種改良、微生物資源開發(fā)和生態(tài)環(huán)境研究提供技術支持，拓展了生命科學研究的邊界。

六、技術壁壘

威尼德 HB-500 原位雜交儀之所以能夠在分子病理研究中展現(xiàn)出的性能，得益于其強大的技術壁壘。在溫控技術方面，搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，經(jīng)過精密的設計和優(yōu)化，實現(xiàn)了 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)原位雜交儀的溫控性能。這種精準的溫控能力能夠確保每張玻片上的實驗條件一致，避免因溫度差異導致的實驗結果偏差。

在濕度控制方面，全密封的濕度控制系統(tǒng)采用先進的密封技術和濕度調(diào)節(jié)裝置，能夠在實驗過程中始終保持濕度≥90% RH，有效防止樣本揮發(fā)和雜交緩沖液濃縮，為核酸探針與靶序列的結合提供了最佳的濕度環(huán)境。這種高效的濕度控制技術是傳統(tǒng)儀器難以實現(xiàn)的，大大提高了實驗的可靠性和重現(xiàn)性。

在兼容性方面，該儀器能夠適配 12 張標準玻片，支持多品牌試劑，無論是常用的商業(yè)試劑還是科研人員自行配制的試劑，都能夠在該儀器上穩(wěn)定使用，具有廣泛的適用性和靈活性。同時，其智能化的操作界面和豐富的用戶程序設置，滿足了不同科研人員的實驗需求，降低了儀器的使用門檻。

七、結論

流式細胞分選細胞原位雜交技術是一種強大的分子生物學研究工具，能夠?qū)崿F(xiàn)對特定細胞亞群內(nèi)目標核酸序列的精準定位和定量分析。威尼德 HB-500 原位雜交儀作為該技術的重要支撐設備，以其精準控溫、高效智能、穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng)原位雜交實驗中面臨的諸多難題，為分子病理研究提供了全新的解決方案。

該儀器在腫瘤病理診斷、感染性疾病檢測、神經(jīng)科學研究、農(nóng)業(yè)與生態(tài)學等多個領域展現(xiàn)出廣泛的應用前景，能夠顯著提升實驗的準確性、效率和可重復性，為科研人員和臨床醫(yī)生提供有力的技術支持。隨著生命科學研究的不斷深入，對實驗設備的要求也越來越高，威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其的性能和技術創(chuàng)新，必將在未來的分子病理研究中發(fā)揮更加重要的作用，推動相關領域的研究取得新的突破。

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參考文獻

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