動脈粥樣硬化中血流誘導的內(nèi)皮細胞重編程

Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis

Subject terms: Cell biology, Systems biology

動脈粥樣硬化是一種主要影響動脈的多因素慢性炎癥性疾病。內(nèi)皮細胞功能障礙和炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展中起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)層的內(nèi)皮細胞與血液直接接觸，并因各種風險因素（如高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓、吸煙和衰老）而變得功能失調(diào)和發(fā)炎，尤其是在與血流紊亂相關(guān)的特定動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域。這些區(qū)域的擾動流的特征是向內(nèi)皮細胞表面?zhèn)鬟f低幅度的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）。內(nèi)皮細胞通過機械感應(yīng)受體（機械傳感器）檢測各種剪切應(yīng)力模式和幅度，并將這些機械信號轉(zhuǎn)化為細胞信號和隨后的結(jié)構(gòu)和功能反應(yīng)。

在這些內(nèi)皮炎癥部位，循環(huán)單核細胞與內(nèi)皮細胞結(jié)合并遷移到內(nèi)皮下空間，分化成巨噬細胞。這些區(qū)域還顯示出對循環(huán)低密度脂蛋白（LDL）膽固醇的滲透性增加，LDL 膽固醇在內(nèi)皮下被氧化并被附近的巨噬細胞攝取，從而促進泡沫細胞發(fā)育并引發(fā)炎癥和巨噬細胞積累的惡性循環(huán)。此外，這些區(qū)域的血管平滑肌細胞（VSMCs）轉(zhuǎn)化為合成表型并遷移到內(nèi)皮下層增殖，導致動脈壁增厚。一些 VSMCs 轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，最終導致脂質(zhì)條紋和纖維脂肪斑塊的形成（圖1 a）。隨著動脈粥樣硬化斑塊向外和向內(nèi)生長、成熟和進展，一些斑塊破裂，導致嚴重的心血管事件，如心肌梗塞和中風。

目前，控制致動脈粥樣硬化內(nèi)皮細胞功能障礙和炎癥的血流調(diào)控（血流敏感）的基因、蛋白質(zhì)和通路可能成為有希望的新治療靶點。為此，美國埃默里大學-佐治亞理工Wallace H. Coulter生物醫(yī)學工程系團隊的一項綜述討論了當前關(guān)于血流敏感基因、蛋白質(zhì)和通路的研究進展，包括與內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化有關(guān)的紊亂血流誘導的內(nèi)皮細胞重編程（FIRE）的新興概念。研究成果發(fā)表于 Nature Reviews Cardiology 期刊題為“Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis”。

圖1    動脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在血流紊亂的部位。

內(nèi)皮細胞的剪切應(yīng)力

血管內(nèi)皮細胞不斷暴露在血流動力學力下：血壓引起的動脈壁正常（跨壁）應(yīng)力和周向應(yīng)力，以及血流引起的內(nèi)皮表面的切向剪切應(yīng)力（圖1 b）。雖然血管壁中的跨壁壓力和周向應(yīng)力主要影響和調(diào)節(jié)內(nèi)側(cè) VSMCs，但流體剪切應(yīng)力主要影響內(nèi)皮細胞，有效調(diào)節(jié)其功能。

由于復(fù)雜的血管幾何形狀和血流動力學條件，血管系統(tǒng)不同區(qū)域的剪切應(yīng)力水平和方向模式差異很大（圖1 c）。在人體動脈的直段、非分支區(qū)域，血流的粘性力超過慣性力，導致穩(wěn)定的單向?qū)恿?，從而向?nèi)皮細胞提供高幅度的 ULS （~15 dyn/cm2）。相反，在彎曲和分支區(qū)域，慣性力變得更加突出，導致紊亂的多向振蕩流，將低幅度的 OSS（約 ±4 dyn/cm2）輸送到內(nèi)皮細胞表面（圖1 d）。

血流的臨床意義在于，動脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在彎曲或分支的血管區(qū)域，這些區(qū)域暴露于流動受干擾的環(huán)境，并存在其他危險因素，如高膽固醇血癥和糖尿病。

血流誘導的動脈粥樣硬化的動物模型

臨床觀察強烈表明，血流紊亂與動脈粥樣硬化發(fā)生部位之間存在相關(guān)性，但其是否直接導致動脈粥樣硬化一直是未知的，直到在動物模型的實驗研究中得到證實。在部分頸動脈結(jié)扎術(shù)（PCL）模型中，左頸動脈（LCA）誘導血流紊亂，具有典型的低幅度 OSS 模式（圖2 a）。在高脂飲食誘導高膽固醇血癥的Apoe?/? 小鼠或過表達PCSK9的C57BL/6小鼠中，PCL 手術(shù)在 2-3 周內(nèi)導致整個 LCA 長度的動脈粥樣硬化快速發(fā)展。重要的是，在該小鼠模型中，對側(cè)右頸動脈（RCA）繼續(xù)暴露于穩(wěn)定的血流中，且不會形成動脈粥樣硬化斑塊，是同一動物的理想對照（圖2 b）。此外，收縮頸動脈袖帶模型涉及在 RCA 的一部分上植入剪切應(yīng)力修改模型（圖2 b），它將 RCA 的該部分暴露于三種不同的剪切應(yīng)力狀態(tài)下：低幅度、穩(wěn)定的血流，這會誘導易損斑塊的發(fā)展；高幅度、穩(wěn)定的血流，無斑塊形成；以及紊亂血流，這會導致穩(wěn)定性斑塊的發(fā)展。該小鼠模型顯示了單頸動脈內(nèi)血流依賴性動脈粥樣硬化的發(fā)展（圖2 b）。這兩種動物模型已在全球眾多實驗室中使用，是研究體內(nèi)血流依賴性內(nèi)皮細胞功能和動脈粥樣硬化機制的極其有價值的工具。

除了這些受干擾血流誘導的動脈粥樣硬化的小鼠模型外，斑馬魚也被用作一種遺傳上易于處理的模型，用于檢查動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件。結(jié)合基因操作方法減少血流量，斑馬魚模型提供了進一步的證據(jù)，證明在高膽固醇血癥條件下，血流紊亂會導致動脈粥樣硬化。

此外，已經(jīng)開發(fā)了許多剪切應(yīng)力的體外模型，包括錐板粘度計、平行板流室和微流體通道。這些體外生物反應(yīng)器將內(nèi)皮細胞暴露在各種剪切條件下，可用于在明確的生物力學環(huán)境中確定剪切應(yīng)力依賴性內(nèi)皮功能的詳細機制（圖2 c、d）。

圖2    血流紊亂誘導的動脈粥樣硬化模型。

血流調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能

體內(nèi)內(nèi)皮細胞不斷暴露于各種血流動力學因素，尤其是與血流相關(guān)的剪切應(yīng)力，它有效地調(diào)節(jié)了內(nèi)皮細胞功能的幾乎所有方面。明確穩(wěn)定血流保護內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)功能和紊亂血流誘導內(nèi)皮功能障礙的機制對于了解血流依賴性動脈粥樣硬化的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。

穩(wěn)定流通過控制緊密連接蛋白表達和與肌動蛋白細胞骨架的附著來促進緊密連接穩(wěn)定性，以及通過 VE-鈣粘蛋白的磷酸化和降解來控制粘附連接完整性，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞通透性。擾動流通過多種機制增加內(nèi)皮細胞增殖和細胞凋亡，包括下調(diào)腫瘤抑制蛋白 p53 的表達和抑制抗凋亡激酶AKT。穩(wěn)定流通過 sirtuin 1 依賴性和 FOXO1 依賴性通路誘導自噬，為內(nèi)皮細胞提供細胞保護機制。擾動流通過 p53 依賴性和 sirtuin 1 依賴性機制誘導內(nèi)皮細胞衰老，從而減少內(nèi)皮細胞遷移并破壞動脈修復(fù)機制。

血流還調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的新陳代謝和氧化還原反應(yīng)。雖然穩(wěn)定血流會降低內(nèi)皮葡萄糖攝取和代謝活性以及編碼糖酵解相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的表達，但紊亂血流會促進糖酵解代謝，導致明顯不同的代謝組學特征和線粒體裂變增加。擾動流還增加了內(nèi)皮活性氧（ROS）的生成和氧化應(yīng)激。在動脈粥樣硬化和高血壓的情況下，內(nèi)皮響應(yīng)擾動流的ROS 生成會增加血管氧化應(yīng)激和 LDL 氧化。

血流紊亂還有效誘導內(nèi)皮細胞炎癥和內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)分化，這在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。擾動流通過增加內(nèi)皮粘附分子（VCAM1、ICAM1 和 E-選擇素）的表達來誘導內(nèi)皮炎癥，這些分子介導單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附。此外，擾動流促進了細胞因子和趨化因子的表達，如 IL-1、IL-6 和 CCL5。血流紊亂可誘導內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化（內(nèi)皮細胞到間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變；EndMT）和免疫樣細胞（內(nèi)皮細胞到免疫細胞轉(zhuǎn)變；EndIT）。

機械傳感器和機械轉(zhuǎn)導

內(nèi)皮細胞通過位于細胞頂端和基底表面、細胞間連接處和細胞內(nèi)的機械傳感器識別流體剪切應(yīng)力（圖3）。在頂端表面，機械傳感器包括質(zhì)膜蛋白，如陽離子通道 PIEZO1 和 P2X 嘌呤受體4、NOTCH1、蛋白激酶、G 蛋白偶聯(lián)受體和叢狀蛋白D1，以及膜相關(guān)結(jié)構(gòu)，如小窩、糖萼和初級纖毛。

在細胞間連接處，血小板內(nèi)皮細胞粘附分子（PECAM1）、VE-鈣粘蛋白和 VEGFR2 形成連接機械感覺復(fù)合物，該復(fù)合物通過 PI3K-AKT 信號介導整合素激活、細胞排列和 eNOS 激活，以響應(yīng)穩(wěn)定血流。

在內(nèi)皮細胞的基底表面，血流誘導細胞外基質(zhì)結(jié)合整合素機械傳感器的構(gòu)象激活和表達變化。穩(wěn)定的血流會激活整合素αvβ3，導致與細胞外基質(zhì)的結(jié)合增加，下游 RHO 信號轉(zhuǎn)導失活。此外，細胞質(zhì)中的肌動蛋白細胞骨架已被證明用作機械感覺結(jié)構(gòu)。

圖3     內(nèi)皮細胞中的機械傳感器和機械信號轉(zhuǎn)導通路。

紊亂血流誘導的內(nèi)皮細胞重編程

該研究人員對 PCL 手術(shù)后同一只小鼠的 LCAs（暴露于擾動流 2 天或 2 周）和 RCAs（暴露于穩(wěn)定流 2 天或 2 周）獲得的單細胞進行了研究，以血流依賴性和時間依賴性方式鑒定內(nèi)皮細胞和其他細胞類型的差異轉(zhuǎn)錄組學和表觀基因組變化。scRNA-seq 和 scATAC-seq 結(jié)果獨立顯示，擾動流以時間依賴性方式誘導小鼠頸動脈細胞組成的動態(tài)變化。

頸動脈包含八個內(nèi)皮細胞簇、四個單核細胞-巨噬細胞簇、一個 VSMC 簇、一個成纖維細胞、一個樹突狀細胞和一個 T 細胞，所有這些細胞在細胞身份和數(shù)量方面都以血流依賴性和時間依賴性方式變化。最有趣的是，頸動脈內(nèi)皮細胞在響應(yīng)血流時是異質(zhì)的和動態(tài)的。在暴露于生理穩(wěn)定血流條件下的 RCA 中，鑒定出四個內(nèi)皮細胞亞簇（E1-E4），并隨著時間的推移保持不變。然而，在暴露于促動脈粥樣硬化擾動流條件的 LCA 中，大多數(shù)健康的內(nèi)皮細胞亞簇（E2-E4）幾乎丟失，而新的內(nèi)皮細胞亞簇（E6 和 E8）出現(xiàn)。此外，在 RCA 內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的 VSMCs 很少，但正如預(yù)期的那樣，紊亂的血流增加了 LCA 中的 VSMCs 數(shù)量。在 LCA 和 RCA 中均發(fā)現(xiàn)成纖維細胞，在 2 天擾動流條件下，LCA 中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最高。盡管單核細胞和巨噬細胞簇在 RCA 中很少見，但 LCA 的單核細胞和巨噬細胞數(shù)量顯著增加，反映出血流紊亂時血管發(fā)生了實質(zhì)性的促炎和促動脈粥樣硬化改變。與巨噬細胞一樣，RCA 中存在很少的樹突狀細胞和 T 細胞，但它們的數(shù)量因 LCA 中的擾動流而增加。

為了了解擾動流誘導內(nèi)皮細胞表型變化的潛在機制，分析了 8 個不同的內(nèi)皮細胞簇的差異基因表達和基因本體論。正如預(yù)期的那樣，典型健康內(nèi)皮細胞簇（E2）表達兩個最著名的機械敏感基因 Klf2 和 Klf4 的較高水平，并且這些基因在暴露于擾動流的內(nèi)皮細胞簇中表達顯著降低，如 LCA 中的 E8。擾動流誘導了內(nèi)皮細胞 E8 簇中基因的表達，這些基因在 VSMCs（Acta2 和 Tagln）、成纖維細胞（Dcn1）和免疫細胞（Cd74、H2-Eb1、H2-Aa 和 H2-Ab1）中也高度表達，表明內(nèi)皮細胞在血流紊亂條件下可能發(fā)生EndMT并獲得免疫細胞樣特征。通過 Panther 基因本體分析比較穩(wěn)定流暴露的 E2 和擾動流暴露的 E8 簇之間的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)擾動流誘導許多與促動脈粥樣硬化通路相關(guān)的已知生物過程，包括炎癥、EndMT、細胞凋亡、血管生成和內(nèi)皮通透性。偽時間軌跡分析和其他差異基因表達和染色質(zhì)可及性分析證實，E8 細胞比 E2 細胞表達更高水平的 EndMT（Acta2、Cnn1、Snai1 和 Tagln）和 EndIT（C1qa、C1qb、C5ar1 和 Tnf） 標記基因。此外，體外培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞長期暴露于擾動流誘導了 EndMT 標志物（SNAI1 和 TAGLN）和 EndIT 標志物（C1QC 和 C5AR1）的表達，表明擾動流可以在沒有任何其他細胞類型（如免疫細胞）的情況下誘導培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細胞重編程。這些結(jié)果表明，紊亂的血流誘導內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇賱用}粥樣硬化表型，其特征是炎癥、EndMT 和 EndIT（即 FIRE）（圖4）。

圖4     單細胞 RNA 測序顯示受擾動流誘導的內(nèi)皮細胞重編程。

總之，來自血流的剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的表型和功能變化，從而阻止或促進動脈粥樣硬化形成。內(nèi)皮細胞通過介導各種機械信號轉(zhuǎn)導途徑的機械傳感器轉(zhuǎn)導這些生物力學線索，進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組變化以及細胞功能。高通量組學結(jié)合體內(nèi)和體外實驗?zāi)Ｐ偷某霈F(xiàn)揭示了許多調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能障礙和動脈粥樣硬化發(fā)展的血流敏感基因、蛋白質(zhì)和通路。穩(wěn)定血流誘導動脈粥樣硬化保護性內(nèi)皮細胞表型，而血流紊亂誘導動脈粥樣硬化表型，其特征是內(nèi)皮形態(tài)和屏障功能改變、內(nèi)皮代謝受損、氧化還原調(diào)節(jié)、增殖和細胞凋亡、炎癥途徑誘導以及轉(zhuǎn)分化為其他細胞類型，例如 EndMT。此外，體內(nèi) scRNA-seq 和 scATAC-seq 研究表明，擾動流不僅會誘導內(nèi)皮炎癥和 EndMT，還會誘導 EndIT，研究人員將其定義為 FIRE（血流誘導的內(nèi)皮細胞重編程）。FIRE 在內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化中的機制和作用是未解之謎，調(diào)節(jié) FIRE 的血流敏感分子可能是新的治療靶點。

參考文獻：Tamargo IA, Baek KI, Kim Y, Park C, Jo H. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023 Nov;20(11):738-753. doi: 10.1038/s41569-023-00883-1. Epub 2023 May 24. PMID: 37225873; PMCID: PMC10206587.

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