異常威克漢姆酵母與釀酒酵母在混合發(fā)酵中的相互作用機(jī)制！

酵母菌是果酒釀造中主要的功能性微生物，根據(jù)其在釀造過程中功能不同而分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）和非釀酒酵母。Sc具有較高的產(chǎn)酒能力與耐受性，在發(fā)酵過程中大多會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)并完成發(fā)酵；非釀酒酵母則能產(chǎn)生更加復(fù)雜的風(fēng)味成分以及胞外酶等代謝物，可以將原料中的物質(zhì)充分釋放，將其轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇、酯等香氣物質(zhì)，提升果酒的品質(zhì)。因此，將Sc和非釀酒酵母用于混合發(fā)酵果酒，能將原料中的風(fēng)味更好地展示出來。

非釀酒酵母中有一類酵母菌在其生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)生較多的酯類香氣成分及其前體，這類酵母菌可以叫做產(chǎn)酯酵母或產(chǎn)香酵母。產(chǎn)香酵母近年來被應(yīng)用于很多食品的生產(chǎn)，如面食的發(fā)酵、醬油、食醋、白酒以及果酒的釀造中，使香氣復(fù)雜化，具有提升產(chǎn)品品質(zhì)的能力。但非釀酒酵母乙醇發(fā)酵能力較弱，常常不能將之用于純種發(fā)酵。近年來很多研究將Sc和產(chǎn)香酵母混合發(fā)酵，但在混合發(fā)酵時(shí)，需要研究混合發(fā)酵過程中的相互作用關(guān)系和規(guī)律，才能更好地控制發(fā)酵各個(gè)階段的菌種特性和代謝，優(yōu)化生產(chǎn)發(fā)酵工藝。

本實(shí)驗(yàn)以前期篩選出的2 種優(yōu)良酵母菌株為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行單菌種及混合培養(yǎng)，通過考察混合發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)變化規(guī)律，分析相互作用中細(xì)胞凋亡、代謝物以及細(xì)胞接觸作用，一方面旨在對(duì)酵母菌相互作用機(jī)理及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有更加深入的認(rèn)識(shí)，另一方面在混合發(fā)酵工藝提升產(chǎn)品風(fēng)味的基礎(chǔ)上，更加準(zhǔn)確調(diào)控微生物的生長(zhǎng)和代謝，使得生產(chǎn)更加系統(tǒng)化。

一、材料與方法

1、材料與試劑

（1）菌種與培養(yǎng)基

Sc ZM-005為從自然發(fā)酵藍(lán)莓酒中篩選出來的1 株產(chǎn)酒能力優(yōu)良且能在WL鑒別培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色和形態(tài)的酵母菌；Wa K-008由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min；WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸錳0.125 g/L，硫酸鎂0.002 5 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌15 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：無水葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌15 min。

2、儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQPL-200立式全溫震蕩培養(yǎng)箱 天津市有限公司；HH-21-6電熱恒溫水浴鍋 上海助藍(lán)儀器科技有限公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JXFSTPRP-24細(xì)胞破碎儀 上海凈信發(fā)展有限公司；NP-30S渦旋混合儀 常州恩培儀器制造商有限公司；LC-LX-H185C臺(tái)式高速離心機(jī) 上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-10生物傳感器分析儀 深圳市西爾曼科技有限公司。

3、方法

（1）菌種活化

將－80 ℃甘油管保藏菌株，劃線于YPD固體平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，將平板上單菌落挑取至100 mL滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，使得培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)達(dá)到108 CFU/mL，備于接種。

（2）共同接種發(fā)酵

對(duì)照組：將Sc和Wa分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5×105 CFU/mL，30 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵停止，發(fā)酵前2 d內(nèi)每隔4 h取樣，稀釋涂布于WL鑒別培養(yǎng)基中，2 d后每隔24 h涂布一次，觀察過程中生物量變化。

實(shí)驗(yàn)組：1）正?；旌习l(fā)酵：將Sc和Wa以1∶1（都為5×105 CFU/mL）比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)方法與對(duì)照組一致；2）不同初始濃度的Wa接種：梯度為5×105、2.5×106、1×107 CFU/mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔2 d涂布于WL固體平板計(jì)數(shù)；3）高濃度Sc接種：Sc以107 CFU/mL接種量，Wa以5×105 CFU/mL同時(shí)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)方法與對(duì)照組一致。

以上實(shí)驗(yàn)均在30 ℃下恒溫培養(yǎng)。

（3）酵母細(xì)胞對(duì)乙醇耐受性

活化好的兩種菌按接種量5×105 CFU/mL接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%接入培養(yǎng)基中）中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，稀釋涂平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，計(jì)算菌落總數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)組均有3 組平行，取平均值。

（4）發(fā)酵上清液制備

制備純Sc發(fā)酵、純Wa發(fā)酵以及混合發(fā)酵上清液，將培養(yǎng)2、4、6 d后的3 個(gè)時(shí)間段發(fā)酵液靜置10 min，分別倒入50 mL已滅菌的離心管，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心2 次，取上清液，再次倒入新的離心管，重復(fù)離心步驟，在超凈臺(tái)中過0.22 μm濾膜，去除剩余酵母細(xì)胞，得到無細(xì)胞的發(fā)酵上清液備用。

（5）死細(xì)胞和破碎細(xì)胞處理

參考Nissen等實(shí)驗(yàn)，100 ℃煮沸等量的Sc細(xì)胞10 min，得到死Sc細(xì)胞，放入100 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)離心2 次后備用；將5 000 r/min離心10 min后的細(xì)胞沉淀放入冷凍細(xì)胞破碎機(jī)中破碎5 min，再次重復(fù)離心，取出破碎細(xì)胞備用。

（6）透析袋實(shí)驗(yàn)

通過Renault等設(shè)計(jì)的一種新型模型，模仿其設(shè)計(jì)透析袋發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，選擇1 000 Da和12 kDa截留分子質(zhì)量的透析袋，發(fā)酵罐內(nèi)加入發(fā)酵培養(yǎng)基，將透析袋和發(fā)酵罐進(jìn)行組合。透析袋100 ℃高溫煮沸10 min備用，將煮好的透析袋放入發(fā)酵罐中，透析袋內(nèi)外加入等量的發(fā)酵培養(yǎng)基，罐口封上封口膜，115 ℃滅菌20 min，發(fā)酵罐透氣測(cè)溫頂蓋65 ℃下滅菌30 min取出，經(jīng)過乙醇消毒后紫外線照射15 min，在超凈臺(tái)中組合，接菌后放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

接種方式：將Wa接種于透析袋內(nèi)，Sc接種于透析袋外，為驗(yàn)證透析袋實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，作為對(duì)照將Sc接種在透析袋內(nèi)，Wa接種在透析袋外，每4 h測(cè)定每組透析袋內(nèi)外的生物量、葡萄糖、乙醇含量，測(cè)定至36 h。接種量均為5×105 CFU/mL。

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次取平均值。

（7）發(fā)酵動(dòng)力學(xué)測(cè)定

3 組分別為純Sc接種、純Wa接種、Sc與Wa混合接種（1∶1）。其中發(fā)酵培養(yǎng)基為20%含糖量的液體YPD培養(yǎng)基，純發(fā)酵以及混合發(fā)酵接種每種菌體接種量都為5×105 CFU/mL。接種后，每隔1 d稱質(zhì)量一次，一直到發(fā)酵結(jié)束為1 個(gè)周期，以CO2質(zhì)量損失測(cè)定其發(fā)酵速率v，計(jì)算如下式所示：

式中：Mn為發(fā)酵第n天總質(zhì)量損失；Mn－1為發(fā)酵第n－1天總質(zhì)量損失。

（8）葡萄糖和乙醇測(cè)定

緩沖液準(zhǔn)備：將緩沖液粉倒入緩沖液瓶，加入5 000 mL純水充分溶解6 h后使用（必須一次性配完5 000 mL，不能拆分配制，否則會(huì)損壞酶膜）。

生物傳感器測(cè)定：進(jìn)行葡萄糖與乙醇標(biāo)定，每次使用前，將葡萄糖（1 g/L）和乙醇（0.5 g/L）標(biāo)準(zhǔn)液從4 ℃取出，系統(tǒng)調(diào)至定標(biāo)操作，將25 μL標(biāo)準(zhǔn)液注入感應(yīng)器中，調(diào)整電極電量，定標(biāo)3 次至系統(tǒng)顯示通過，每測(cè)定10 次樣品后需重新定標(biāo)進(jìn)樣（乙醇量程0～1 g/L、葡萄糖量程0～2 g/L），樣品條件：稀釋倍數(shù)使得葡萄糖與乙醇都在量程范圍內(nèi)才能測(cè)定。

樣品測(cè)定：將發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶液混勻，在無菌超凈臺(tái)中取樣，首先取1 mL樣品放入離心管，2 000 r/min離心5 min，吸取離心清液中不同部分（上、中、下）溶液各100 μL，稀釋于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容（稀釋100 倍），再用標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定生物傳感器，使得系統(tǒng)標(biāo)定成功。測(cè)定時(shí)加入25 μL的樣品稀釋液，測(cè)定樣品葡萄糖和乙醇含量，均測(cè)定3 次取平均值。

（9）生物量測(cè)定

平板計(jì)數(shù)法：在混合培養(yǎng)條件下，由于Sc和Wa在電子顯微鏡下生長(zhǎng)形態(tài)相似，肉眼難以區(qū)分，有研究發(fā)現(xiàn)，WL選擇培養(yǎng)基能分辨不同的酵母菌，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sc在WL鑒別培養(yǎng)基中呈現(xiàn)黃色凸起狀，而Wa在WL鑒別培養(yǎng)基中呈現(xiàn)白色扁平狀，故可以采用WL鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

血球計(jì)數(shù)板法：添加亞甲基藍(lán)溶液對(duì)酵母活細(xì)胞進(jìn)行染色再計(jì)數(shù)。

4、數(shù)據(jù)處理

利用OrginPro 2018C軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析、利用Adobe illustrator CS6進(jìn)行優(yōu)化作圖和組合。

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