穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建全攻略：從理論到實(shí)踐的生物制藥核心技術(shù)解析

為何穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株成為生物制藥領(lǐng)域的“兵家必爭(zhēng)之地”？

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株被稱為“藥物研發(fā)的基石”，是單克隆抗體、雙抗、疫苗、ADC等生物制品規(guī)?；a(chǎn)的核心環(huán)節(jié)，還是藥物生產(chǎn)成本、效率和質(zhì)量的關(guān)鍵決定因素。一株高產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞株有可能直接縮短藥物上市周期3-5年。穩(wěn)定細(xì)胞株因其穩(wěn)定性高，適用于各種研究應(yīng)用，包括重組蛋白、抗體生產(chǎn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和功能性研究等。

那么，如何打造一株理想的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株呢？

義翹神州在重組表達(dá)方面不斷深耕，積累了大量穩(wěn)定株開發(fā)的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，在提高穩(wěn)定細(xì)胞株的生產(chǎn)能力、改善細(xì)胞狀態(tài)等方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)。義翹神州可提供從基因合成到穩(wěn)定細(xì)胞株交付的一站式服務(wù)，為客戶的研究提供助力。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建全流程：從載體設(shè)計(jì)到單克隆篩選

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或者干擾特定基因表達(dá)的細(xì)胞株。與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株便于長(zhǎng)期觀察基因?qū)τ诩?xì)胞功能的影響及蛋白相互作用，尤其適合于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株將外源基因克隆至含有某種篩選標(biāo)記的載體上，將載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞并整合到染色體中，利用載體攜帶的篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，從而得到可穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建通常包含：載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、Pool篩選、克隆篩選、PCB建庫、MCB/WCB建庫、細(xì)胞株穩(wěn)定性研究等內(nèi)容。

生產(chǎn)用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建首先從表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染開始。

首先，轉(zhuǎn)染過程是將表達(dá)目的蛋白的基因整合到載體中，再將該載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)水平與基因拷貝數(shù)、基因整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。常用的轉(zhuǎn)染方式有鈣轉(zhuǎn)、電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等。

常用的宿主細(xì)胞是CHO。CHO細(xì)胞種類多樣，包括CHO-K1、CHO-S、CH-DG44、CHOZN-GS、CHO-K1SV、CHO-K1SV GS-KO、CHO-K1 GS等。不同的CHO宿主細(xì)胞在細(xì)胞株構(gòu)建中的表現(xiàn)各異。

接著，采用不同的篩選試劑獲得正確高效表達(dá)目的基因的細(xì)胞池（Pool）。

為了更高效地篩選出高表達(dá)水平的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，表達(dá)載體上除了包含蛋白本身的基因以外，往往還含有各種篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記一般可以被分為兩大類：一類是以G418為代表的抗生素類篩選標(biāo)記；另一類是以MTX為代表的細(xì)胞代謝篩選標(biāo)記。

不同種類的篩選標(biāo)記（源自文獻(xiàn)：DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720）

當(dāng)目的基因被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)，按照一定的細(xì)胞密度在合適的篩選壓力下進(jìn)行傳代培養(yǎng)后便可獲得細(xì)胞池（Pool）。針對(duì)不同的宿主細(xì)胞可以采取不同的Pool篩選方式。例如：采用搖瓶進(jìn)行大規(guī)模Pool篩選，或采用孔板進(jìn)行迷你Pool篩選。Pool的表達(dá)量取決于轉(zhuǎn)染的方式、篩選壓力以及目的基因整合情況。

對(duì)于不同的目的蛋白分子，在Pool階段需要考察的標(biāo)準(zhǔn)不同。例如：對(duì)于常規(guī)新藥抗體，往往表達(dá)量為第-一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于生物類似物，在Pool階段則需著重考察各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)與原研藥的差異；對(duì)于雙特異性抗體，在此階段需開始考察正確裝配的比例，以期降低克隆篩選階段的風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞池Pool中的每個(gè)細(xì)胞特性各異，具有不同的基因整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)、生長(zhǎng)速率等，因此需將其中具有高產(chǎn)、穩(wěn)定表達(dá)特性的細(xì)胞個(gè)體分離出來分別加以富集培養(yǎng)，獲得數(shù)百甚至上千的候選克隆供進(jìn)一步篩選。

最后，單克隆篩選是關(guān)鍵操作步驟。

通常采用以下組合形式篩選單克隆，確保單個(gè)細(xì)胞形成單克隆：

義翹神州穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)

義翹神州擁有流式細(xì)胞儀、Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)等儀器設(shè)備，歡迎大家咨詢探討相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株單克隆篩選方案。同時(shí)，義翹神州擁有GS系統(tǒng)和可用于藥品申報(bào)的整套系統(tǒng)，能夠完成各類穩(wěn)定細(xì)胞株的開發(fā)篩選工作。

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【參考文獻(xiàn)】

1.  Feng Li, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody production. mAbs, 2010. DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720

2. Noh, et al. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep, 2018. doi.org/10.1038s41598-018-23720-9