TDP-43與漸凍癥：守護(hù)or背叛？

TDP-43是一種由414個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，屬于hnRNP（異質(zhì)核糖核蛋白）家族成員。它包含兩個(gè)RNA識(shí)別基序（RRMs），這些基序通過(guò)兩個(gè)60個(gè)殘基長(zhǎng)度的氨基酸折疊形成保守的三維結(jié)構(gòu)，能夠與RNA進(jìn)行單鏈結(jié)合和序列特異性結(jié)合。TDP-43的這種結(jié)合能力使其能夠參與細(xì)胞內(nèi)的RNA代謝過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、選擇性剪接以及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等。該蛋白由李文渝在2006年發(fā)現(xiàn)，并揭示了其在神經(jīng)退行性疾病中的重要作用。

結(jié)構(gòu)與功能

在正常細(xì)胞中，TDP-43主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，參與基因表達(dá)的調(diào)控。然而，在細(xì)胞應(yīng)激環(huán)境下，TDP-43可穿梭至細(xì)胞質(zhì)中，與其他蛋白相互作用形成應(yīng)激顆粒（stress granules），以應(yīng)對(duì)細(xì)胞環(huán)境的變化。這種應(yīng)激顆粒是通過(guò)可逆的液液相分離（liquid-liquid phase separation）聚集成的無(wú)膜結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞在應(yīng)激條件下維持穩(wěn)態(tài)。

在疾病狀態(tài)下，TDP-43蛋白在胞漿中形成異常蛋白聚集，這是（ALS、漸凍癥）和額顳葉變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病額顳葉癡呆(FTD)的主要病理標(biāo)志性蛋白之一。這種異常的蛋白聚集被認(rèn)為與漸凍癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

 圖1.TDP-43在軸突積累的機(jī)制。

軸突中病理性TDP-43形成和積累的各種可能性的運(yùn)動(dòng)單元示意圖。A.軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的改變可能導(dǎo)致TDP-43向更多的順行或更少的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)變，從而改變其在軸突和突觸中的局部濃度。B. TDP-43通過(guò)細(xì)胞外囊泡擴(kuò)散。TDP-43從細(xì)胞中清除的一種方法是通過(guò)細(xì)胞外囊泡。這些含有TDP -43的囊泡可以從Schwann細(xì)胞或骨骼肌中移除，并被吸收到鄰近的軸突中，這些軸突不能承受蛋白質(zhì)過(guò)載，并且缺乏適當(dāng)?shù)臋C(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)積累。C .蛋白質(zhì)平衡的改變是由軸突中不受調(diào)節(jié)的TDP-43合成驅(qū)動(dòng)的，或者如所示，由于其磷酸化狀態(tài)導(dǎo)致TDP-43蛋白水解和軸突清除過(guò)程中的功能障礙。

TDP-43與漸凍癥（ALS）

在ALS和FTD患者的脊髓和大腦受損區(qū)域中，可以檢測(cè)到大量存在的TDP-43蛋白聚集。這些聚集的TDP-43蛋白主要以淀粉樣形式存在，與淀粉樣蛋白、神經(jīng)纖維纏結(jié)及海馬硬化等病理特征密切相關(guān)。

研究表明，TDP-43在ALS中的作用尤為關(guān)鍵。在ALS患者中，無(wú)論TARDBP基因是否突變，TDP-43蛋白的病理性異常幾乎普遍存在。這種異常包括TDP-43從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并形成包涵體團(tuán)塊，這些團(tuán)塊會(huì)干擾TDP-43的正常功能，產(chǎn)生毒性并阻礙細(xì)胞過(guò)程，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖2.軸突/NMJ中TDP-43的擬病理機(jī)制。

關(guān)于軸突TDP-43的生物學(xué)和病理作用的最新證據(jù)表明，TDP-43積聚在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的遠(yuǎn)端軸突和突觸前隔室中并形成pTDP-43凝聚物。這些結(jié)構(gòu)隔離了對(duì)線粒體和核糖體蛋白質(zhì)的局部合成至關(guān)重要的mRNA。這些局部蛋白質(zhì)合成的中斷引發(fā)了線粒體功能障礙、活性氧(ROS)產(chǎn)生和局部蛋白質(zhì)合成進(jìn)一步受損之間的惡性循環(huán)。由于NMJ嚴(yán)格依賴于這些過(guò)程，這特別影響了NMJ，從而促進(jìn)了NMJ和軸突變性。

案例分享

研究者從兩名有ALS合并FTD臨床病史的患者的額葉和運(yùn)動(dòng)皮層中提取了聚集的TDP-43。這兩名患者在運(yùn)動(dòng)皮層和脊髓中都有聚集的TDP-43的圓形NCIs，以及散發(fā)性ALS特征的束狀包體12(圖3a，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3a)。在額葉、顳葉和頂葉皮質(zhì)的所有皮質(zhì)層中也觀察到NCIs和少突膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)包體，很少有營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)突(圖3a, b，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b)。這些發(fā)現(xiàn)與4期ALS TDP-43病理和b型皮質(zhì)TDP43病理一致，這兩種病理在ALS合并FTLD患者中都很常見。免疫印跡證實(shí)，提取的聚集體由全長(zhǎng)TDP-43和CTFs組成，并在S409和S410位點(diǎn)磷酸化(pS409/S410)(圖3b，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c)，與先前在ALS和FTLD12中觀察到的結(jié)果一致。免疫金陰性染色電鏡(immune -EM)顯示TDP-43聚集體呈螺旋狀投影寬度為10-15 nm的細(xì)絲(圖3d，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d)，類似于從FTLD6患者中提取的聚集TDP-43，以及ALS和FTLD腦組織中原位成像的聚集TDP-43。

圖3 | TDP-43 pathology of ALS with FTLD.

 拓展數(shù)據(jù)圖3 | TDP-43 pathology of ALS with FTLD continued.

最新的研究還發(fā)現(xiàn)，TDP-43的異常表達(dá)或突變還會(huì)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要細(xì)胞類型之一，具有維持神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)定、參與突觸傳遞和神經(jīng)保護(hù)等多種功能。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中TDP-43的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)干擾素誘導(dǎo)的趨化因子基因表達(dá)，產(chǎn)生過(guò)量的趨化因子，進(jìn)而激活神經(jīng)元中的趨化因子受體，改變突觸前功能并使神經(jīng)元過(guò)度興奮，最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)生。

TDP-43作為一種多功能的核酸結(jié)合蛋白，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要的作用。其異常表達(dá)或突變會(huì)導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步揭示TDP-43異常導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的具體機(jī)制，并開發(fā)針對(duì)TDP-43異常的有效治療藥物。同時(shí)，我們也需要加強(qiáng)對(duì)神經(jīng)退行性疾病的早期篩查和診斷工作，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療這些疾病。

TDP-43 Recombinant Rabbit mAb     

貨號(hào)：S0B0731數(shù)據(jù)分享

ICC shows positive staining in HeLa cells. Anti-TDP-43 antibody was used at 1/500 dilution (Green) and incubated overnight at 4°C. Goat polyclonal Antibody to Rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor® 488) was used as secondary antibody at 1/1000 dilution. The cells were fixed with 4% PFA and permeabilized with 0.1% PBS-Triton X-100. Nuclei were counterstained with DAPI (Blue). Counterstain with tubulin (Red).

IHC shows positive staining in paraffin-embedded human colon. Anti- TDP-43 antibody was used at 1/1000 dilution, followed by a HRP Polymer for Mouse & Rabbit IgG (ready to use). Counterstained with hematoxylin. Heat mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH9.0 was performed before commencing with IHC staining protocol.

IHC shows positive staining in paraffin-embedded human testis. Anti- TDP-43 antibody was used at 1/1000 dilution, followed by a HRP Polymer for Mouse & Rabbit IgG (ready to use). Counterstained with hematoxylin. Heat mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH9.0 was performed before commencing with IHC staining protocol.

WB result of TDP-43 Recombinant Rabbit mAb

Primary antibody: TDP-43 Recombinant Rabbit mAb at 1/1000 dilution

Lane 1: HeLa whole cell lysate 20 µg

Lane 2: SH-SY5Y whole cell lysate 20 µg

Secondary antibody: Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), HRP conjugated at 1/10000 dilution
Predicted MW: 45 kDa

Observed MW: 40 kDa

Flow cytometric analysis of 4% PFA fixed 90% methanol permeabilized HeLa (Human cervix adenocarcinoma epithelial cell) labelling TDP-43 antibody at 1/500 dilution (0.1 μg) / (Red) compared with a Rabbit monoclonal IgG (Black) isotype control and an unlabelled control (cells without incubation with primary antibody and secondary antibody) (Blue). Goat Anti - Rabbit IgG Alexa Fluor® 488 was used as the secondary antibody.