枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)與優(yōu)缺點及應(yīng)用進展！

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種土壤來源的低G+C、內(nèi)生孢子革蘭氏陽性細菌，也是一種重要的原核表達宿主，具有很高的應(yīng)用價值，其培養(yǎng)簡單快速，具有較強的分泌蛋白質(zhì)的能力、非致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表達宿主，是微生物研究領(lǐng)域中的一種重要模式菌株。目前，已經(jīng)有很多外源基因在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中成功復制、表達，該表達系統(tǒng)的進一步開發(fā)將會帶來更高效、更經(jīng)濟、更安全的應(yīng)用價值。

一、枯草芽孢表達系統(tǒng)介紹

1、枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵優(yōu)缺點

相較于傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌的優(yōu)勢越來越明顯，它作為基因工程菌的出發(fā)菌具有巨大潛力和優(yōu)勢：

（1）非致病性。枯草芽孢桿菌在自然界中廣泛存在于動物腸道當中，被認為是腸道益生菌，有一定制備發(fā)酵食物的歷史，不產(chǎn)制熱致敏蛋白質(zhì)和各種毒素，安全程度可以達到食品級。

（2）枯草芽孢桿菌細胞具有很強的蛋白質(zhì)胞外分泌能力，大約有300多種蛋白質(zhì)可以被直接分泌至胞外，相比較工業(yè)上常用的宿主菌大腸桿菌而言，簡化甚至可以去除部分目的蛋白的純化步驟。

（3）枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不容易形成包涵體。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，如果待表達的外源蛋白質(zhì)的編碼序列含有大量連續(xù)的稀有密碼子，那么表達水平通常偏低，甚至翻譯提前終止；包涵體導致蛋白質(zhì)不可溶，這使得難以分離和純化目的蛋白質(zhì)，但是枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)不存在以上問題，在這些方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。

（4）枯草芽孢桿菌是好氧嗜溫菌，不需要制造無氧環(huán)境，也不需要特殊的培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期短，生長速度快，發(fā)酵所需的培養(yǎng)基配方簡單，發(fā)酵技術(shù)成熟，易實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

然而，對于枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的研究起步較晚，仍有很多需要人們繼續(xù)探索的方面：

（1）盡管模式菌株的全基因組測序已經(jīng)完成，但仍有近50％基因的功能尚不明確；

（2）自然界中能自發(fā)形成感受態(tài)細胞狀態(tài)的菌株較少，感受態(tài)持續(xù)時間短，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化方法針對性較強；

（3）枯草芽孢桿菌內(nèi)部存在限制性修復系統(tǒng)，重組質(zhì)粒易不穩(wěn)定，造成質(zhì)粒丟失；

（4）自身胞外蛋白酶表達能力強，可能引起目的蛋白降解；

（5）拷貝數(shù)通常較低，蛋白表達量不高；

（6）芽孢桿菌菌株多樣性高，其啟動子復雜性高，目前己知的σ因子有14種之多，兼容性不強。

2、枯草芽孢桿菌表達載體

常用的枯草芽孢桿菌表達載體分為三類：噬菌體載體、整合型質(zhì)粒載體和自主復制型質(zhì)粒載體，其中自主復制的質(zhì)粒應(yīng)用最多，整合型質(zhì)粒能夠有效解決重組質(zhì)粒在宿主內(nèi)不穩(wěn)定、易丟失這一問題。

目前常用的質(zhì)粒載體有：穿梭質(zhì)粒載體pEB60，pUB18，pEB10和pWB980，整合型載體pMutin-GFP+，pSG115，pMutin4，pSG1156，詳情見下表。

3、枯草芽孢桿菌啟動子基本結(jié)構(gòu)

（1）啟動子結(jié)構(gòu)

啟動子是調(diào)控外源基因高效表達的關(guān)鍵元件，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游，可以供RNA聚合酶識別和結(jié)合，使酶與啟動子形成二元復合物，從而與模板DNA準確結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄。原核啟動子的核心區(qū)域為TSS上游200bp至下游100bp，該區(qū)域存在小段保守序列，如枯草芽孢桿菌sextama-35區(qū)（TTGACA）、Pri-bmow-10區(qū)（TATAAT），根據(jù)這些保守序列可以對啟動子進行簡單的預測和分析。

（2）枯草芽孢桿菌啟動子的σ因子

原核基因的RNA聚合酶由5個亞基組成，分別為α亞基、β亞基、β'亞基、ω因子和σ因子。σ因子能夠協(xié)助核心酶識別特定啟動子序列，以便結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始部位，σ因子與核心酶瞬時結(jié)合，二者的結(jié)合與分離為RNA聚合酶的重組提供機會，轉(zhuǎn)錄開始后σ因子就不再有作用。目前，已知的枯草芽孢桿菌σ因子有14種，每一種σ因子的功能和數(shù)量并不相同，其中含量最多的是σA因子，它是轉(zhuǎn)錄必須基因，是營養(yǎng)期最重要的σ因子，負責轉(zhuǎn)錄管家基因，相關(guān)基因數(shù)約358個，占σ因子總量的90%~95%，相當于大腸桿菌中的σ70。

4、啟動子的分類

對于重組蛋白的生產(chǎn)，啟動子強弱直接決定了該蛋白的表達水平。根據(jù)不同啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平能力的不同，可以將其分為強啟動子和弱啟動子；根據(jù)啟動子誘導機制的不同，又可以分為組成型啟動子、誘導型啟動子、時期特異性啟動子和自誘導啟動子。本文主要介紹的是枯草芽孢桿菌的組成型啟動子和誘導型啟動子。

（1）組成型啟動子

組成型啟動子又稱非特異性啟動子，是指不需要添加任何誘導物就可以持續(xù)表達目的蛋白的啟動子，它的啟動能力強，成本低，常被用于構(gòu)建載體時的表達元件。常見的枯草芽孢桿菌組成型啟動子有P43啟動子和噬菌體啟動子，其中P43被普遍應(yīng)用于各種研究，是胞苷脫氨酶基因(cdd)的啟動子，它是有σA和σB兩個因子負責識別的重疊啟動子。研究表明，組成型啟動子P43的啟動強度強于誘導型啟動子PamyE和PsacB。

（2）誘導型啟動子

誘導型啟動子是指受環(huán)境變化或化學誘導來調(diào)控基因表達的啟動子，在代謝工程中，可以針對不同誘導型啟動子改變誘導劑的種類及濃度，實現(xiàn)目的基因不同強度的表達。誘導劑可以與阻遏蛋白Lac I結(jié)合，使之與操縱位點分離，致下游基因得到表達。

在枯草芽孢桿菌中見的誘導劑是IPTG、木糖和蔗糖。除此之外，Yang等構(gòu)建的以誘導型啟動子Pglv(Pglv-M1)為表達元件的表達系統(tǒng)也在枯草芽孢桿菌中得到廣泛應(yīng)用，該啟動子以麥芽糖作為誘導物，價格低廉，安全無毒，且對代謝反應(yīng)元件cre進行突變改造后獲得的新啟動子Pglv-M1受到葡萄糖的抑制作用大大降低，工業(yè)應(yīng)用價值較大。

5、通過啟動子改造實現(xiàn)基因高效表達

a.啟動子的克隆

目前，針對啟動子的克隆方法主要有三種，一是啟動子探針載體篩選法，二是PCR技術(shù)克隆法，三是軟件分析法。

利用探針型載體篩選、克隆啟動子是指通過限制性內(nèi)切酶隨機切割外源ＤＮＡ得到不同大小的核苷酸片段（擬啟動子片段），將這些片段連接到含有互補粘性末端的載體上，檢測下游報告基因的表達活性，以判斷擬啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性。

構(gòu)建啟動子探針型質(zhì)粒載體常見的報告基因有綠色熒光蛋白報告基因、熒光素酶基因、四環(huán)素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因等。

軟件分析法是通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行比對和大數(shù)據(jù)分析，常見的分析平臺有Sofiberry等,可以對一段序列進行是否存在啟動子的判斷及位置分析，同時還可以模擬啟動子能力強弱,方便快捷，但是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的分析可能存在一定誤差，還需要后續(xù)實驗進一步驗證。

b.改造啟動子以實現(xiàn)目的基因的高效表達

目前大多用于外源表達的啟動子為天然啟動子，啟動子起始轉(zhuǎn)錄能力的強弱與其自身結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。常見的啟動子改造辦法有以下幾種：構(gòu)建復合啟動子；啟動子核心保守區(qū)域替換雜交；啟動了保守序列突變等。

（1）構(gòu)建復合啟動子

自然界中，除了單個啟動子作用于一個基因的情況，還存在復合啟動子作用于一個基因的情況，如雙啟動子或者重疊啟動子等。復合啟動子可以提供更多的RNA聚合酶結(jié)合位點，使外源基因的轉(zhuǎn)錄水平高于單啟動子。用于表達B-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的復合啟動子Hpa-Panye-表達系統(tǒng)的表達量是單啟動子Pay，表達系統(tǒng)表達量的1.3倍。

（2）啟動子核心保守區(qū)域替換雜交

枯草芽孢桿菌啟動子的核心保守區(qū)域有sextama-35區(qū)和Pri-bmow-10區(qū)，它們的典型序列是TTGACA和TATAAT。-35區(qū)和-10區(qū)分別是識別和結(jié)合RNA聚合酶的區(qū)域，不同啟動子這兩個區(qū)域?qū)NA聚合酶的識別、結(jié)合能力可能略有不同，若將不同啟動子的強識別或強結(jié)合的優(yōu)勢區(qū)域組合替換雜交，使其進行優(yōu)勢互補形成優(yōu)勢的核心區(qū)域，則會更好的開始轉(zhuǎn)錄。

二、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)應(yīng)用進展

枯草芽孢桿菌的研究無論在理論還是產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)等方面均已取得巨大成功，如工業(yè)發(fā)酵、傳統(tǒng)發(fā)酵食品制備和植物病害生物防治等。

1、枯草芽孢桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成本低、耗費時間少且有利于環(huán)境，是一種重要的表達宿主，既是有益菌，又是表達外源蛋白的工具，已廣泛用于合成生物學、代謝工程和工業(yè)酶的生產(chǎn)。重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵能力強，在大規(guī)模發(fā)酵中表現(xiàn)出的潛力，通過對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，已證明枯草芽孢桿菌 WB600 可以作為生產(chǎn) BglTO 的合適宿主，其產(chǎn)物活性與已有商業(yè)酶相比更高效，有望在釀造工業(yè)中應(yīng)用。此外，β-甘露聚糖酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)、有機溶劑耐受蛋白酶(OSP)、杜納糖等多種工業(yè)產(chǎn)品均已成功在枯草芽孢桿菌中表達。

2、枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌對人類是安全的，被界定為“GRAS”(Generally Ｒecognized as Safe)，其在工業(yè)生產(chǎn)、疫苗開發(fā)、環(huán)境保護和肽庫構(gòu)建中都起到重要作用。將枯草芽孢桿菌 MF497446 施用到受鎘(Cd)污染的土壤中，可促進植物生長并消除(或至少減少)農(nóng)作物中 Cd 的積累，確保食品安全，降低人類健康風險。作為安全宿主，在枯草芽孢桿菌168中通過表達GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)可以提高茶氨酸的產(chǎn)量。

3、枯草芽孢桿菌在醫(yī)學上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)具有藥理活性的重組蛋白方面具有多種優(yōu)勢，如質(zhì)量和效率、安全性和分泌能力等，因此優(yōu)于大腸桿菌。枯草芽孢桿菌是一種具有益生菌特性的內(nèi)生孢子和生物膜形成細菌，其芽孢具有的物理、化學以及生化特性，是口服疫苗遞送的強大平臺。通過構(gòu)建一系列重組枯草芽孢桿菌菌株，測試了口服芽孢后狗的免疫應(yīng)答能力，并據(jù)此建立了枯草芽孢桿菌用作腸道疫苗制劑的主要步驟。研究也已證明枯草芽孢桿菌芽孢的口服遞送可抵抗草魚呼腸孤病毒感染。

三、總結(jié)

枯草芽孢桿菌是科學研究中的重要模式菌種，是一種具有研發(fā)潛力的微生物，其安全系數(shù)高、對環(huán)境無污染、高效且應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已逐漸發(fā)展成生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點。隨著基礎(chǔ)研究和應(yīng)用技術(shù)更深入的研究和推進，未來枯草芽孢桿菌將成為一個超級分泌細胞工廠。

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