微生物發(fā)酵之發(fā)酵過程與操作方法及工作流程！

什么是微生物發(fā)酵？

微生物發(fā)酵亦稱微生物工程，是生物工程的重要組成和基礎(chǔ)，它利用微生物的作用并通過近代工程技術(shù)來實(shí)現(xiàn)有用物質(zhì)向工業(yè)化生產(chǎn)或其他產(chǎn)業(yè)過程轉(zhuǎn)化的科學(xué)技術(shù)體系。

它以微生物學(xué)和生物化學(xué)及遺傳學(xué)的理論為基礎(chǔ)，開發(fā)白然界微生物資源及其所有的潛在功能，使之應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。其主要包括原料的處理和有用微生物的篩選和誘變；菌種工業(yè)應(yīng)用的培養(yǎng)條件的選擇；代謝的調(diào)節(jié)和控制；生物反應(yīng)等的研究和設(shè)計(jì)；發(fā)酵工藝中各種參數(shù)的測(cè)試與白控；產(chǎn)物的分離和提取等。

微生物發(fā)酵技術(shù)與基因工程、細(xì)胞工程、酶工程相互密切結(jié)合、相互滲透和相互促進(jìn)，是科研成果從實(shí)驗(yàn)室向商業(yè)化轉(zhuǎn)移的重要課題?？偟膩碚f，微生物發(fā)酵既是開發(fā)生物資源的關(guān)鍵技術(shù)，也是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)。

微生物發(fā)酵的工作流程是怎樣的？

首先要了解微生物發(fā)酵到底是什么？其實(shí)我們見過的蘋果等食物的腐爛也是微生物在發(fā)酵，但是這里我們指的是利用微生物，在適宜的條件下，將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要產(chǎn)物的過程。那么這個(gè)過程主要有哪些步驟呢？

一、菌體的培育

1、是菌體自然選育

就是在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過程，叫做自然選育。菌種的自發(fā)突變往往存在兩種可能性：菌種衰退，生產(chǎn)性能下降;或者是代謝更加旺盛，生產(chǎn)性能提高。具有實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和善于觀察的工作人員，就能利用自發(fā)突變而出現(xiàn)的菌種性狀的變化，選育出優(yōu)良菌種。例如，在谷氨酸發(fā)酵過程中，人們從被噬菌體污染的發(fā)酵液中分離出了抗噬菌體的菌種。又如，在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，從某一批次高產(chǎn)的發(fā)酵液取樣進(jìn)行分離，往往能夠得到較穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。但自發(fā)突變的頻率較低，出現(xiàn)優(yōu)良性狀的可能較小，需堅(jiān)持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才能收到效果。

2、是菌體誘變育種

誘變育種是指用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變，再從中篩選出符合要求的突變菌株，供生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)用。誘變育種與其他育種方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、速度快和收效大的優(yōu)點(diǎn)，至今仍是一種重要的、廣泛應(yīng)用的微生物育種方法。誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個(gè)部分。

二、菌種的選取

菌種經(jīng)誘變處理后，會(huì)產(chǎn)生各種各樣的突變類型。如何從中挑選出所需要的突變類型呢?一般要經(jīng)過初篩和復(fù)篩兩個(gè)階段。下面以青霉素產(chǎn)生菌高產(chǎn)突變菌種的篩選為例說明。將經(jīng)誘變處理的菌液按一定濃度稀釋后，涂布在平板培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，將單個(gè)菌落挑到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，再將斜面上的菌落逐個(gè)接種到搖瓶中，振蕩培養(yǎng)后測(cè)它們的抗生素效價(jià)。這就是初篩。初篩中所得到的超過對(duì)照效價(jià)10%以上的菌種，再進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的過程與初篩基本相同，不同的是一般將斜面上的單個(gè)菌落接種到三個(gè)搖瓶中，得出平均效價(jià)。復(fù)篩可進(jìn)行1～3次。由此篩選出的高產(chǎn)穩(wěn)定菌種還要經(jīng)過小型甚至中型試驗(yàn)，才能用到發(fā)酵生產(chǎn)中。

三、培養(yǎng)基的配置

(1)原料：碳源，氮源，生長(zhǎng)因子，無機(jī)鹽和水。

(2)原則：目的要明確，營養(yǎng)要協(xié)調(diào)，PH要適宜。

四、滅菌

發(fā)酵過程中不能有雜菌污染,不僅要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌,還要對(duì)發(fā)酵裝置進(jìn)行滅菌,通入的空氣也要進(jìn)行滅菌.滅菌不僅要?dú)⑺离s菌細(xì)胞,還要?dú)⑺姥挎吆玩咦印?/span>

五、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

擴(kuò)大培養(yǎng)可以縮短微生物生長(zhǎng)的調(diào)整期。

六、微生物發(fā)酵過程

是發(fā)酵的中心階段。 關(guān)鍵是控制發(fā)酵的條件，如溫度，pH，溶氧，通氣量與轉(zhuǎn)速等。原因是環(huán)境條件的變化，不僅會(huì)影響菌種的生長(zhǎng)繁殖，還會(huì)影響菌種代謝產(chǎn)物的形成。影響發(fā)酵過程的因素 影響發(fā)酵過程的因素主要有以下幾個(gè)方面。

1、溫度控制

溫度對(duì)微生物的影響是多方面的。首先，溫度影響酶的活性。在溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體生長(zhǎng)和代謝加快，發(fā)酵反應(yīng)的速率加快。當(dāng)超過溫度范圍以后，隨著溫度的升高，酶很快失活，菌體衰老，發(fā)酵周期縮短，產(chǎn)量降低。溫度也能影響生物合成的途徑。例如，金色鏈霉菌在30 ℃以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)，但當(dāng)溫度超過35 ℃時(shí)，則只合成四環(huán)素而不合成金霉素。此外，溫度還會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以及菌種對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收等。因此，要保證正常的發(fā)酵過程，就需維持溫度。但菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需的溫度不一定相同。如灰色鏈霉菌的生長(zhǎng)溫度是37 ℃，但產(chǎn)生抗生素的溫度是28 ℃。通常，必須通過實(shí)驗(yàn)來確定不同菌種各發(fā)酵階段的溫度，采取分段控制。

2、適宜的pH值

pH能夠影響酶的活性，以及細(xì)胞膜的帶電荷狀況。細(xì)胞膜的帶電荷狀況如果發(fā)生變化，膜的透性也會(huì)改變，從而有可能影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌。此外，pH還會(huì)影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的分解等。因此，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH。但不同菌種生長(zhǎng)階段和合成產(chǎn)物階段的pH往往不同，需要分別加以控制。在發(fā)酵過程中，隨著菌體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的積累，發(fā)酵液的pH必然會(huì)發(fā)生變化。如當(dāng)尿素被分解時(shí)，發(fā)酵液中的NH+4濃度就會(huì)上升，pH也隨之上升。在工業(yè)生產(chǎn)上，常采用在發(fā)酵液中添加維持pH的緩沖系統(tǒng)，或通過中間補(bǔ)加氨水、尿素、碳酸銨或碳酸鈣來控制pH。目前，國內(nèi)已研制出檢測(cè)發(fā)酵過程的pH電極，用于連續(xù)測(cè)定和記錄pH變化，并由pH控制器調(diào)節(jié)酸、堿的加入量。

3、溶解氧

氧的供應(yīng)對(duì)需氧發(fā)酵來說，是一個(gè)關(guān)鍵因素。從葡萄糖氧化的需氧量來看，1 mol的葡萄糖氧化分解，需6 mol的氧;當(dāng)糖用于合成代謝產(chǎn)物時(shí)，1 mol葡萄糖約需1.9 mol的氧。因此，好氧型微生物對(duì)氧的需要量是很大的，但在發(fā)酵過程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，然而氧很難溶于水。在101.32 kPa、25 ℃時(shí)，氧在水中的溶解度為0.26 mmol/L。在同樣條件下，氧在發(fā)酵液中的溶解度僅為0.20 mmol/L，而且隨著溫度的升高，溶解度還會(huì)下降。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充大量的氧，并要不斷地進(jìn)行攪拌，這樣可以提高氧在發(fā)酵液中的溶解度。

4、泡沫

在發(fā)酵過程中，通氣攪拌、微生物的代謝過程及培養(yǎng)基中某些成分的分解等，都有可能產(chǎn)生泡沫。發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫是正?，F(xiàn)象，但過多的持久性泡沫對(duì)發(fā)酵是不利的。因?yàn)榕菽瓡?huì)占據(jù)發(fā)酵罐的容積，影響通氣和攪拌的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致代謝異常，因而必須消除泡沫。常用的消泡沫措施有兩類：一類是安裝消泡沫擋板，通過強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩;另一類是使用消泡沫劑 營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，特別是碳氮比、無機(jī)鹽和維生素的濃度，會(huì)直接影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。如在谷氨酸發(fā)酵中，NH+4濃度的變化，會(huì)影響代謝途徑(見谷氨酸發(fā)酵)。因此，在發(fā)酵過程中，也應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行控制。 以制造谷氨酸為例，發(fā)酵在發(fā)酵過程中，氧、溫度、pH和磷酸鹽等的調(diào)節(jié)和控制如下：

①氧。谷氨酸產(chǎn)生菌是好氧菌，通風(fēng)和攪拌不僅會(huì)影響菌種對(duì)氮源和碳源的利用率，而且會(huì)影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。

②溫度。菌種生長(zhǎng)的溫度為30～32 ℃。當(dāng)菌體生長(zhǎng)到穩(wěn)定期，適當(dāng)提高溫度有利于產(chǎn)酸，因此，在發(fā)酵后期，可將溫度提高到34～37 ℃。

③pH。谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵的pH在7.0～8.0。但在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的利用，代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)液的pH會(huì)不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會(huì)上升;當(dāng)糖被利用生成有機(jī)酸時(shí)，pH會(huì)下降。

④磷酸鹽。它是谷氨酸發(fā)酵過程中必需的，但濃度不能過高，否則會(huì)轉(zhuǎn)向纈氨酸發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，常用離子交換樹脂法等進(jìn)行提取。

七、分離提純

代謝產(chǎn)物：可采用蒸餾，萃取，離子交換等方法提取。

菌體自身：可采用過濾，沉淀等方法從培養(yǎng)液中分離出來。

八、應(yīng)用范圍

微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件。發(fā)酵工程的應(yīng)用范圍有：

⑴醫(yī)藥工業(yè)，

⑵食品工業(yè)，

⑶能源工業(yè)，

⑷化學(xué)工業(yè)，

⑸農(nóng)業(yè)：改造植物基因;生物固氮;工程殺蟲菌生物農(nóng)藥;微生物養(yǎng)料。

⑹環(huán)境保護(hù)等方面。但微生物發(fā)酵的過程一定要注意不能被感染，一旦感染其他的菌種，將不能培育成我們所需要的產(chǎn)品。

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