顯微課堂 | 到底是什么決定了光學(xué)系統(tǒng)分辨率？

無(wú)論是光學(xué)領(lǐng)域從業(yè)者，還是在工作場(chǎng)景使用到光學(xué)成像設(shè)備的研究人員，一定會(huì)遇到一個(gè)問(wèn)題：我使用的或者調(diào)研的光學(xué)系統(tǒng)分辨率到底是由什么決定？有人說(shuō)是物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，有人會(huì)提到像素值，還有人眼成像和顯示成像的關(guān)系是什么？下面，我會(huì)完整和系統(tǒng)的講講決定光學(xué)系統(tǒng)分辨率的因素以及它們之間的關(guān)系。

光學(xué)系統(tǒng)有很多種，它們的結(jié)構(gòu)和成像原理都有所不同，如望遠(yuǎn)鏡、顯微鏡、各種成像儀，所以我們先確定一個(gè)相對(duì)經(jīng)典的成像系統(tǒng)：光學(xué)顯微鏡，來(lái)展開(kāi)講解。

我們先簡(jiǎn)單的回顧一下光學(xué)的一些基礎(chǔ)知識(shí)，光具有波粒二相性質(zhì)，所以光是一種電磁波，我們下面所介紹的主要定義為波段在390nm—770nm可見(jiàn)光波段的常規(guī)顯微鏡。

那么為什么我們?nèi)搜蹮o(wú)法直接看到很小的細(xì)節(jié)呢？因?yàn)槔碚撋?，我們眼球兩邊的肌肉伸縮可以幫助眼睛對(duì)20厘米到無(wú)限遠(yuǎn)處的物體聚焦（圖1.1），當(dāng)我們想分辨一個(gè)物體的細(xì)節(jié)時(shí)，需要一定的視角才行（圖1.2），所以我們無(wú)法看清玻片上樣品的細(xì)節(jié)，因?yàn)樗鼈兲×耍沟媚愕囊暯欠浅Ｐ?，以致無(wú)法分辨它們。但你也無(wú)法靠近樣品來(lái)增加視角，因?yàn)樘鼰o(wú)法聚焦（圖1.3）。

所以，我們需要一個(gè)媒介，來(lái)放大樣品的像，這就是顯微鏡。顯微鏡可以說(shuō)是各種棱鏡的組合（圖2.1）。

在討論光學(xué)分辨率由什么決定前，我們先需要理解什么是光學(xué)分辨率，以及為什么存在光學(xué)分辨率極限。瑞利判據(jù)：在成像光學(xué)系統(tǒng)中，分辨本領(lǐng)是衡量分開(kāi)相鄰兩個(gè)物點(diǎn)的像的能力。由于衍射，系統(tǒng)所成的像不再是理想的幾何點(diǎn)像，而是有一定大小的光斑（艾里斑），當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)過(guò)于靠近，其像斑重疊在一起，就可能分辨不出是兩個(gè)物點(diǎn)的像。即光學(xué)系統(tǒng)中存在著一個(gè)分辨極限，這個(gè)分辨極限通常采用瑞利提出的判據(jù)：當(dāng)一個(gè)艾里斑的中心與另一個(gè)艾里斑的第一級(jí)暗環(huán)重合時(shí)，剛好能分辨出是兩個(gè)像。

瑞利距離為能分辨兩個(gè)艾利班的最小距離，這個(gè)距離有一個(gè)公式：Rayleigh distance =0.61λ/N.A。其中λ光學(xué)系統(tǒng)中光源的波長(zhǎng)，N.A為物鏡的數(shù)值孔徑。

所以，我們繼續(xù)展開(kāi)，一般光源的波長(zhǎng)是恒定的，顯微鏡常用的LED白光取550nm，那么決定性的變量就是物鏡的數(shù)值孔徑N.A。N.A值物鏡的物理特性，它由物鏡的直徑 (D) 和工作距離 (WD) 決定，N.A也有其公式：N.A=n*sin a/2。（其中n為光工作介質(zhì)的折射率，a為光進(jìn)出透鏡時(shí)最大錐角）。講到這里，我們就可以理解為什么光學(xué)分辨率有極限值，它由物鏡N.A決定，N.A越大，分辨率越高；N.A由工作介質(zhì)折射率和透鏡最大錐角決定，折射率一般為空氣固定1（部分介質(zhì)能稍微提高折射率：如油鏡），那么就只能通過(guò)讓物鏡更靠近樣品和增大物鏡的口徑這兩方面提高最大錐角α，又因?yàn)楣絅.A =n*sin a/2中sin函數(shù)有最大值為1，所以就假設(shè)物鏡已經(jīng)做到理想狀態(tài)α角使N.A取到最大值1（空氣介質(zhì)），那么瑞利距離（分辨率）0.61λ/N.A就算得最小值為0.61x550/1=335nm，該值為白光下顯微鏡的極限分辨率。

接下來(lái)我們繼續(xù)討論一個(gè)問(wèn)題：現(xiàn)代顯微鏡通常搭配攝像頭連接電腦成像，那么在顯示器上的成像分辨率還是不是光學(xué)分辨率，和通常衡量圖像分辨率的參數(shù)：像素又是什么關(guān)系？

在解答這個(gè)問(wèn)題之前，我們簡(jiǎn)單講解一下攝像頭的工作原理：簡(jiǎn)單來(lái)講，攝像頭是把平時(shí)到人眼的光信號(hào)轉(zhuǎn)化為顯示器上成像的電信號(hào)，如果光信號(hào)成像的分辨率是瑞利距離，那么電信號(hào)成像的分辨率就是像素，它們之間的關(guān)系是：顯示分辨率是攝像頭像元尺寸（單個(gè)像素尺寸）和采樣率直接影響實(shí)際可達(dá)到的分辨率，它不會(huì)超過(guò)光學(xué)分辨率。像元尺寸限制：若攝像頭像元尺寸大于光學(xué)分辨率，則無(wú)法分辨細(xì)節(jié)。例如，若光學(xué)分辨率為5微米，而像元尺寸為10微米，則實(shí)際分辨率受限于攝像頭。奈奎斯特采樣定理：為充分解析目標(biāo)，像元尺寸需小于線分辨率的1/2。所以搭配足夠分辨率的攝像頭，才能全發(fā)揮出光學(xué)系統(tǒng)本身的分辨能力。

我們總結(jié)一下，光學(xué)系統(tǒng)的分辨率主要由衍射極限決定，在光學(xué)顯微鏡中，衍射極限由物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，在有探測(cè)器（攝像頭）的光學(xué)系統(tǒng)中，最終成像分辨率由光學(xué)分辨率和攝像頭的像元尺寸共同決定，攝像頭并不能提高光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。