賽默飛abi7500實時熒光定量pcr儀做實驗的話下一步是什么

完成ABI 7500實時熒光定量PCR（qPCR）實驗后，下一步的關鍵步驟包括數(shù)據(jù)分析、結果驗證和實驗記錄整理。以下是詳細的后續(xù)操作指南：

一、ABI 7500數(shù)據(jù)分析

ABI 7500軟件會自動生成擴增曲線、熔解曲線（SYBR Green法）和Ct值等數(shù)據(jù)，需進行以下分析：

1、擴增曲線檢查：確保所有樣本的擴增曲線呈典型的S形，指數(shù)期明顯，平臺期穩(wěn)定。異常的擴增曲線（如無擴增、非特異性擴增）需排查原因。

2、熔解曲線分析（SYBR Green法）：單一尖銳峰表明特異性擴增，多峰或寬峰可能提示引物二聚體或非特異性產物。

3、Ct值提取：用于定量分析，軟件可自動計算，但需手動調整閾值（通常設在指數(shù)擴增期）以提高準確性。

標準曲線評估（絕對定量）：檢查擴增效率（90%-110%）、R2值（≥0.98）及線性范圍。

二、結果驗證

1、重復實驗：若個別樣本數(shù)據(jù)異常（如Ct值偏差大），需重復實驗。建議整板重做以確?？杀刃?，避免僅重做部分孔導致批次誤差。

2、陰性/陽性對照確認：確保陰性對照無擴增，陽性對照Ct值在預期范圍內。

3、引物優(yōu)化：若熔解曲線異常（如黃三角警告），可能需重新設計引物或優(yōu)化退火溫度。

三、數(shù)據(jù)導出與報告生成

1、導出數(shù)據(jù)：軟件支持導出Ct值、熒光數(shù)據(jù)等，格式可為Excel或文本文件。

2、相對定量計算（如2?ΔΔCt法）：需內參基因校正，確保樣本間歸一化。

3、結果可視化：繪制柱狀圖、熱圖等展示基因表達差異或病原體載量。

四、實驗記錄與儀器維護

1、記錄實驗參數(shù)：包括程序設置、試劑批次、樣本信息等，便于追溯。

2、儀器維護：清潔樣品槽，檢查光源壽命（鹵鎢燈約2000小時），定期校準。

3、數(shù)據(jù)備份：建議使用光盤或加密存儲，避免U盤直接拷貝（部分實驗室規(guī)定）。

五、常見問題處理：

1、蒸發(fā)問題：更換高質量PCR管或增大反應體系（如30 μL）。

2、氣泡干擾：上機前瞬離心去除。