【儀器科普】液相色譜儀（HPLC）的介紹和使用

一、儀器構(gòu)造與核心組件

1. 輸液系統(tǒng)
   由高壓泵、流動相貯存器和梯度洗脫裝置組成。高壓泵提供穩(wěn)定流速（通常0.1-10 mL/min），確保流動相以恒定壓力通過色譜柱。梯度洗脫裝置可動態(tài)調(diào)整流動相組成（如極性、pH值），實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物的高效分離。

2. 進(jìn)樣系統(tǒng)
   采用六通閥或自動進(jìn)樣器，通過定量環(huán)精確控制進(jìn)樣量（通常1-100 μL）。進(jìn)樣前需用0.22 μm濾膜過濾樣品，避免顆粒堵塞色譜柱。

3. 分離系統(tǒng)
   色譜柱是核心部件，由不銹鋼或鈦合金管制成，內(nèi)徑2-5 mm，長度10-25 cm，填充粒徑3-10 μm的固定相（如硅膠基質(zhì)鍵合C18、氨基或氰基官能團(tuán)）。反相色譜柱（如C18）適用于非極性化合物分離，正相色譜柱（如硅膠）用于極性物質(zhì)分析。

4. 檢測系統(tǒng)
   常用紫外-可見光檢測器（UV-Vis），檢測波長范圍190-400 nm，靈敏度可達(dá)ng級。熒光檢測器適用于痕量分析，質(zhì)譜檢測器（LC-MS）可提供分子量信息，用于未知物鑒定。

5. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
   集成色譜工作站，實(shí)時采集信號并生成色譜圖，通過積分算法計算峰面積、保留時間等參數(shù)，支持方法開發(fā)、報告生成等功能。

二、操作流程與關(guān)鍵步驟

1. 流動相準(zhǔn)備
   • 按比例配制流動相（如甲醇:水=70:30），用0.45 μm濾膜過濾后超聲脫氣10分鐘，避免氣泡干擾。
   • 水相流動相需當(dāng)日配制，防止微生物滋生。
2. 色譜柱平衡
   • 安裝色譜柱時注意流向箭頭，新柱需用甲醇過渡至流動相。
   • 以1.0 mL/min流速沖洗30分鐘，直至基線平穩(wěn)（波動<5%）。
3. 儀器參數(shù)設(shè)置
   • 流速：0.5-1.5 mL/min（根據(jù)柱效調(diào)整）。
   • 柱溫：25-40℃（控制±0.1℃精度）。
   • 檢測波長：根據(jù)化合物最大吸收波長設(shè)定（如254 nm）。
   • 進(jìn)樣體積：10-20 μL（自動進(jìn)樣器精度±0.5%）。
4. 樣品分析與清洗
   • 進(jìn)樣后觀察壓力曲線（正常壓力波動<10%），異常時立即停機(jī)檢查。
   • 分析完成后，先用高水相（90%水）沖洗15分鐘，再用有機(jī)相（甲醇）沖洗30分鐘，流速不超過色譜柱耐受值。

三、典型應(yīng)用領(lǐng)域

1. 制藥行業(yè)
   • 藥物純度檢測：分離抗生素中的降解產(chǎn)物，靈敏度達(dá)0.1%。
   • 穩(wěn)定性研究：通過梯度洗脫監(jiān)測片劑溶出曲線，評估藥物釋放行為。
2. 環(huán)境監(jiān)測
   • 飲用水分析：檢測酚類化合物（如雙酚A），檢測限低至0.01 μg/L。
   • 土壤污染篩查：分離多環(huán)芳烴（PAHs），符合EPA標(biāo)準(zhǔn)方法。
3. 食品檢測
   • 添加劑分析：定量測定果汁中的糖分（果糖、葡萄糖）及防腐劑（苯甲酸）。
   • 營養(yǎng)質(zhì)量評估：通過氨基酸分析儀聯(lián)用技術(shù)，測定蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值。

四、維護(hù)與故障排除

1. 日常維護(hù)
   • 每周更換在線過濾器濾芯，每月用異丙醇超聲清洗單向閥。
   • 長期不用時，反相柱保存在純甲醇中，正相柱保存在正己烷中。
2. 常見故障處理
   • 壓力過高：檢查色譜柱入口篩板是否堵塞，用50%甲醇反向沖洗。
   • 基線漂移：校準(zhǔn)檢測器氘燈，檢查流通池是否污染。
   • 峰分叉：更換色譜柱或降低進(jìn)樣量，避免柱過載。

五、技術(shù)發(fā)展趨勢

1. 超高效液相色譜（UPLC）
   采用1.7 μm粒徑固定相，分離效率提升3倍，分析時間縮短至傳統(tǒng)HPLC的1/3。

2. 二維液相色譜（2D-LC）
   通過正交分離機(jī)制（如反相×離子交換），解決復(fù)雜基質(zhì)（如生物樣本）中痕量組分的分離難題。

3. 智能控制技術(shù)
   集成AI算法自動優(yōu)化梯度程序，實(shí)現(xiàn)方法開發(fā)的“一鍵式”操作，提升分析效率。

液相色譜儀憑借其高分離度、高靈敏度和廣泛適用性，已成為化學(xué)、生物、環(huán)境等領(lǐng)域不可少的分析工具。嚴(yán)格遵循操作規(guī)范與維護(hù)流程，可確保儀器長期穩(wěn)定運(yùn)行，為科研與生產(chǎn)提供可靠數(shù)據(jù)支持。