細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料。

二、實(shí)驗(yàn)原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過(guò)程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法zui重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

上圖是本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體中陽(yáng)離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。

本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。

三、實(shí)驗(yàn)材料與器材

1、材料

293T細(xì)胞
MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒
DMEM培養(yǎng)基
鏈霉素/青霉素（雙抗）
FCS（小牛血清）
PBS（磷酸鹽緩沖溶液）
胰酶/EDTA消化液
轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）