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隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA 的方法和應(yīng)用
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA 的方法和應(yīng)用
1.RAPD 技術(shù)的原理和特點(diǎn)
RAPD 技術(shù)建立在PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，它是利用一系列隨機(jī)排列的寡核苷酸（通常為十聚體）為引物，對(duì)所研究的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)EB 染色或放射自顯影來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 片段的多態(tài)性，這些擴(kuò)增DNA 片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA 多態(tài)性。
RAPD 所用的一系列引物各不相同，但對(duì)于任一特定的引物來(lái)說(shuō)，它同基因組DNA 序列有其特定的結(jié)合位點(diǎn)。這些特定的結(jié)合位點(diǎn)在基因組的某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR 擴(kuò)增條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置，且引物的3 端相距在一定長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，就可擴(kuò)增出片段。因此，如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA 片段的插入、缺失或堿基突變，就可能導(dǎo)致這些結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化。通過(guò)對(duì) PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)即可探知基因組DNA 在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性。
進(jìn)行RAPD 分析時(shí)可用引物數(shù)很多，雖然對(duì)每一個(gè)引物而言，其檢測(cè)基因組DNA 多態(tài)性的區(qū)域是有限的，但利用一系列引物則可使檢測(cè)區(qū)域覆蓋整個(gè)基因組。因此，RAPD 可以對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。
RAPD 技術(shù)與其他DNA 多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)如 RFLP （ restriction fragment length polymorphism）、DNA 指紋圖（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，還具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①RAPD 技術(shù)可以在對(duì)受試物種（包括動(dòng)物、植物和微生物）缺乏任何分子生物學(xué)研究的背景下，直接對(duì)基因組進(jìn)行多態(tài)性分析；②操作簡(jiǎn)便，一次RAPD 擴(kuò)增實(shí)際上就是一次簡(jiǎn)單的PCR 反應(yīng)，適合大量樣本的快速分析；③所需模板DNA 量極少，一般一次擴(kuò)增只需5～50ng 的DNA。因此可以從毛發(fā)、脫落組織甚至動(dòng)物的排泄物中提取微量DNA 進(jìn)行直接擴(kuò)增。這對(duì)于瀕危動(dòng)物和價(jià)值很高的種畜、禽的基因組分析是十分有效的（王文等 1994；陳*等 1997，1998；Gwakisa 等 1994；Yi 1995；Tibayrenc 等 1993；Wachira 1995）。
2. RAPD 的基本操作方法
RAPD 的操作方法大體上包括DNA 提取、擴(kuò)增、電泳和染色等幾個(gè)主要步驟。具體的操作過(guò)程見(jiàn) Williams 等（1990，1993）和 Welsh 等（1990）的論述。隨著 RAPD 技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)也作了一些改動(dòng)（Bucci，Menozzi 1993；Dawson 等1993；Lawson 等1994）。
2.1 RAPD 模板的制備 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA 的方法和應(yīng)用
2.l.1 動(dòng)物組織總 DNA 的提取
取新鮮動(dòng)物組織材料，如肝臟、腎臟或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750μl 的STE（0.1mol／dm3 NaCl，20mmol／dm3EDTA，10mmol／dm3 Tris-HCl，pH 值 8.0）、80μl 10％SDS和8μl 20mg／ml 的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小時(shí)后，用酚、氯仿、異戊醇（25:24:1）和氯仿－異戊醇（24:1）分別抽提一次。每次抽提時(shí)間為12～24 小時(shí)。上清液用等體積的異丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用適量的TE 溶解，置于4℃冰箱中備用。（生物秀實(shí)驗(yàn)頻道——打造專(zhuān)業(yè)生物實(shí)驗(yàn)中心 www.bbioo.com）
2.1.2 植物及其真菌的總DNA 提取
取50～500mg 植物或真菌的新鮮材料，分別經(jīng)95％的乙醇、70％的乙醇和超凈水清洗。將材料剪碎后，在材料中加入700μl 十六烷基*基溴化銨（CTAB）提取液（2％CTAB，1.4mol／dm3NaCl，0.2％ 2-巰基乙醇，20mmol／dm3EDTA，100mmol／dm3Tris-HCl，pH 值8.0）。在56℃下消化12～24 小時(shí)。用酚、酚－氯仿－異戊醇（25:24:1）和氯仿－異戊醇（24:1）分別抽提一次，每次抽提時(shí)間為12～24 小時(shí)。將上清液用等體積的異丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用適量的TE 溶解，然后置于 4℃冰箱中備用。
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