慧德易教您在色譜柱出現(xiàn)故障時的解決方法
選樣了一根好的色譜柱,再加上有效的維護與預防,可以避免不少意外故障的發(fā)生。當然誰也不能保護色譜柱“永遠”不出故障,任何一根色譜柱zui終都會因為柱效下降直到報廢。柱損壞的標志是:①塔板數(shù)下降;②峰形改變;③壓力增加;④保留時間變化。有時往往是幾種情況伴隨著同時發(fā)生。
1、塔板數(shù)下降
在色譜柱使用過程中,塔板數(shù)會不斷下降.一般情況下,進2000個樣品后柱效N值要降低50%,(但也不能一概而論),而用C18,柱梯度分析氨基酸,進100個血清樣品之后,柱效就下降50%。這兩種情況的差別之所以這么大,關(guān)鍵在于處理樣品的方法不同。
如果柱效很快下降,應考慮上節(jié)所提到的人為不利因素。N值突然下降(如一個工作日內(nèi)),應考慮柱頭塌陷或進了不合格的樣品。如果使用了不同系統(tǒng)的色譜柱造成柱效下降,是某系統(tǒng)中存在柱外效應。新建立的方法中柱效下降,可能是樣品和其它內(nèi)在因素引起,此時要采取相應措施,防止繼續(xù)給柱造成危害。
2、峰形變壞
出現(xiàn)拖尾峰、分叉峰或非高斯峰的原因很多,但總是與塔板數(shù)驟然下降在一起的。峰形變壞而保留時間不變,多半是柱受到阻塞(不銹鋼燒結(jié)片),或者柱頭有了空穴。
3、壓力增加
和柱塔板數(shù)不斷減少一樣,在使用過程中柱壓慢慢增加,可視為正常。如果壓力一下子增加過高,應考慮兩種可能,一是樣品沉積在柱內(nèi),二是柱內(nèi)硬件阻塞(未考慮系統(tǒng)其它部分的阻塞)。
對于*種情況,要用能溶解所用樣品的溶劑沖洗。沖洗時拆開柱與檢測器之間接頭,正向沖洗或?qū)⒅隹诮釉诒蒙戏聪驔_洗(如果柱條件許可),使用大約30~50mL溶劑。不要讓沖洗液通過檢測器流動池,以防污染。在沖洗過程中不斷檢查,直到壓力恢復正常為止。如沖洗無效,應該考慮是第二種情況,先換燒結(jié)不銹鋼過濾片,拆下柱,擰開柱頭上的壓帽,持垂直方向小心取出不銹鋼過濾片,換上新的(不是洗過的舊濾片)。換濾片時盡量不要攪動柱頭填料,如有塌陷,可用同種填料中乙醇調(diào)成糊狀補平柱頭,壓緊,壓平,柱性能可恢復如前。如果柱頭填料己臟,可挖去2~3mm,用新填料補平。
4、保留時間的改變
保留時間的變化指兩種類型的情況,*種是同一根柱樣品間的保留變化,第二種類型主要是填料的差異造成的,許多實驗都會碰到,現(xiàn)討論如下。
不同牌號的色譜柱分離的色譜峰保留時間可在小范圍內(nèi)移動,但峰的順序和分辨率不變,可改變流速或溶劑強度(反相色譜加水調(diào)節(jié))進行校正。如果譜圖中色譜順序發(fā)生了變化,或者兩峰重疊在一起,問題就比較嚴重。保留時間發(fā)生大的變化,主要由柱填料硅酸相互作用所致,另外有次級保留因素的影響。硅膠為基質(zhì)的填料表面含有硅醇,有的封尾填料可部分去掉硅醇、不封尾填料的硅膠表面硅醇基更多。酸性或堿性分子可與硅醇發(fā)生不同程度的相互作用。硅酸與樣品分子作用的強弱,因不同批號的硅膠和不鍵合相填料而異。即使同批號的硅膠而不同批號的鍵合相也有差異。硅醇對陽離子或堿性樣品影響zui大。參照下列要求做可以減少色譜柱之間保留時間的變化。
(1)僅用同一廠商的色譜柱。實際上不具可操作性,但zui起碼作某一專門分析方法時要用同一廠商的色譜柱。
(2)設計分離條件,使保留值變化zui?。ń藴实姆椒ǎ?/p>
(3)選用液相色譜系統(tǒng)或色譜柱對次級保留因素(外界)靈敏度zui低。
(4)換新柱時調(diào)整分析條件保持舊柱的保留值(改變條件)。這一步工作是*的,在長期的常規(guī)分析中,不會從頭至尾用一根柱,中間總要換新柱,每換一次,都應仔細地調(diào)整各組分的保留。
在實際工作中,應考慮到可能會發(fā)生什么問題,怎樣預防這些問題的發(fā)生。
*,前面提到的作某一專門分析盡量用同一批號的色譜柱。也可與廠商接洽,提出特殊的要求。
第二,選擇硅醇影響zui小的分離條件,減少柱間的差異。如在流動相中添加三乙胺抑制硅醇的作用。
第三,許多色譜工作者認為,在流動相中加入離子對試劑更能抗硅醇的干擾,使保留具有更好的重復性。
不管什么情況下引起保留值的明顯變化,都應該改善分離條件。
改善特別差的峰的分離度,并使保留值穩(wěn)定下來。例如用梯度洗脫分析體液中的氨基酸,這種復雜的樣品有20多個組分,保留稍有變化可能對分離就產(chǎn)生災難性的結(jié)果。一些組分,如偏向酸性或堿性的組分很易發(fā)生保留值的改變,應用不同流動相的組成、pH值和緩沖液的濃度,可以改善關(guān)鍵色譜峰間的分離。色譜峰分離度變差,可能會系統(tǒng)地改變保留值。
塔板數(shù)降低、壓力增高、峰形變差、保留值變化可能同時發(fā)生,可能都是由色譜柱引起的。下表的內(nèi)容可幫助找到一些故障的原因,有些內(nèi)容將在后面的章節(jié)中詳細討論。
表11-1 由色譜柱引起的故障
故 障 | 現(xiàn)象 | 解決辦法 |
過濾片阻塞 柱頭塌陷 鍵合相流失 樣品阻塞 強吸附的樣品 | 壓力增高,N下降,峰形差 峰分叉,N下降 保留改變,峰形差,N下降 高壓 N下降,保留減小 | 倒柱沖洗或換過濾片 修補柱頭,可恢復80%以上 換柱 用能溶解樣品的溶劑沖洗柱 強溶劑反沖 |
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