人胚胎干細胞實驗的流程

人胚胎干細胞保存所需材料

  由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供清潔級孕13.5d ICR小鼠，用于制備小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層，處置符合動物倫理學標準的動物實驗的過程。人胚胎干細胞系PKU由北京大學第三醫(yī)院生殖中心建立并提供;kryo-550-16程序降溫儀為英國planner公司產(chǎn)品,由液氮壓力泵、液氮罐、層流冷凍箱、溫度傳感器組成。

人胚胎干細胞實驗方法

   人胚胎干細胞系接種在PKU小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層，Ⅳ型膠原酶消化和通道，分成人胚胎干細胞的三組冷凍保存。程序降溫法:用吸管將消化后人胚胎干細胞吹成若干團塊,取65個團塊移入配制的凍存液中,裝入麥管進行三段式降溫,即22℃~-7℃,每分鐘降溫2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃~-30℃,每分鐘降溫0.3℃→-30℃~-150℃,每分鐘降溫10℃。降至-150℃時置液氮中保存。

   改進的慢速冷凍法：一種包含人類胚胎干細胞培養(yǎng)及血清替代管，B管中的人類胚胎干細胞和二甲亞砜，顆粒60進入管道A，B和隨后的液體移管的培養(yǎng)液中，混合-70℃，前兩天搬進液氮。改進的慢速冷凍法：一種包含人類胚胎干細胞培養(yǎng)及血清替代管，B管中的人類胚胎干細胞和二甲亞砜，顆粒60進入管道A，B和隨后的液體移管的培養(yǎng)液中，混合-70℃，前兩天搬進液氮。傳統(tǒng)慢速凍存法:將60個團塊直接放入添加二甲亞砜的人胚胎干細胞培養(yǎng)基中混勻,分裝入凍存管,-4℃放置1h,-70℃第2天移入液氮長期保存。

人胚胎干細胞實驗后的評估

   融化后，將細胞保持完整和不分散從人胚胎干細胞聚集體回收的形態(tài)，回收率比較三組細胞，狀態(tài)復制的生長，分化的克隆程度。鑒定程序降溫組人胚胎干細胞的生物學特性。復蘇率:程序降溫組、改良慢速凍存組、傳統(tǒng)慢速凍存組的細胞復蘇率分別為78.5%、56.7%和23.3%,組間比較差異有顯著性意義（x2=6.81~13.89,P0.01）。

   生物學特性：第10代后解凍程序酷胚胎干細胞染色體核型正常，表面抗原鑒定人類胚胎干細胞特異性生物學特性的組：第10代后核型正常的解凍程序酷團的胚胎干細胞，人胚胎干細胞特異性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表達呈陽性,RT-PCR可檢測到nanog基因表達,SSEA-4及OCT-4陽性表達率分別為83.44%、89.38%。結論:①程序降溫法是冷凍保存人胚胎干細胞的有效方法,解凍后的干細胞在繼續(xù)培養(yǎng)過程中仍可保持其正常核型和生物學特性。②在不具備程序降溫儀的條件下,采用改良慢速凍存法保存胚胎干細胞也是可行的。