士鋒生物Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞

測定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。取得有活性的細(xì)胞應(yīng)根據(jù)不同目的，采用不同方法，考慮（1）細(xì)胞純度；（2）細(xì)胞獲得量；（3）細(xì)胞活力；（4）使用方法的簡易程度和本室條件等。目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞。
　　（一）　原理:
　　常用來分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W水性高，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。
　　（二）　方法:
　　1.　在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。
　　2.　取肝素抗凝靜脈血與等量Hank"s液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
　　3.　離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank"s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶（如下圖），單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
　　4.　用毛細(xì)血管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank"s液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細(xì)胞兩次。
　　5.　末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。
　　單個(gè)核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)／1毫升細(xì)胞懸液）＝
　　　　　　　　　4個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)
　　　　　　　　　──────────　×　10４×2（稀釋倍數(shù)）
　　　　　　　　　　　　　　4
　　6.　細(xì)胞活力檢測：死的細(xì)胞可被染成蘭色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率。
　　　　　　　　　　　　　活細(xì)胞數(shù)
　　　　　活細(xì)胞百分率＝──────　×100％
　　　　　　　　　　　　　總細(xì)胞數(shù)
　　用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上?！　?（三）　試劑和材料:
　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺（商品名為淋巴細(xì)胞分離液）。
　　Hank"s液（無Ca２＋、Mg２＋）
　　10％小牛血清RPMI1640
　　0.2％臺酚蘭染色液，用生理鹽水或等滲的PBS配制。
　　肝素用Hank"s液或生理鹽水稀釋成500單位／ml，牽9凝人外周血肝素用量約為50單位／1毫升血。
　　短中管、毛細(xì)滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
　　無菌干燥注射器針頭。
　　碘酒，75％酒精，無菌棉球，鑷子，橡皮止血帶。
　　血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡、水平式離心機(jī)。
　?。ㄋ模∽⒁馐马?xiàng):
　　1.　抽取人外周靜脈血時(shí)要注意無菌操作。
　　2.　操作全程應(yīng)盡可能短時(shí)間內(nèi)完成，以免增加死細(xì)胞數(shù)。
　　3.　用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，使保持清晰的界面。
　　4.　小鼠、兔等動物淋巴細(xì)胞比重與人不同，犛&配制相應(yīng)密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。