水質(zhì)微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

通過(guò)本試驗(yàn)，了解食品檢驗(yàn)中水質(zhì)微生物檢測(cè)的基本方法。

一、水樣的采集

1.自來(lái)水

先將水用清潔布拭干，并用攝子夾消毒棉花沾酒精灼燒水3min滅菌，再打開(kāi)水使水流5min后，以滅菌的三角瓶或生理鹽水瓶接取水樣，以待檢測(cè)。

2.池水、河水或湖水

應(yīng)取距水面10～15cm的深層水，先將滅菌的帶塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞塞好，再?gòu)乃腥〕?，立即檢驗(yàn)，否則需放入冰箱保藏。

二、細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定（SPC）

1.樣品稀釋與制備

（1）自來(lái)水：用滅菌吸管吸取1mL 水樣，注入滅菌的培養(yǎng)皿中，共做兩個(gè)平皿。然后倒入約15 mL已溶化并冷卻至45℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并輕輕搖晃，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待冷卻后倒置于36±1℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

（2）池水、河水或湖水等：用無(wú)菌吸管吸取檢測(cè)水樣1mL于*支9mL生理鹽水試管中，搖勻，再?gòu)牡?/span>1支稀釋試管中吸取1mL于第2支生理鹽水的試管中，如此類推，做成一系列的稀釋液。一般稀釋度可選擇為10-1、10-2、10-3、10-4，若水樣混濁或污染嚴(yán)重的可再進(jìn)一步稀釋至適宜稀釋度。自zui后三個(gè)稀釋度的試管中各吸取1mL稀釋液于培養(yǎng)皿中，每稀釋度做二個(gè)平皿，傾注入約15mL 已溶化并冷卻至45℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，并輕晃平皿，使之混勻，待冷卻后倒置于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h?！?/span>

2.菌落計(jì)數(shù)方法

待平皿培養(yǎng)24h長(zhǎng)出菌落后作平皿菌落計(jì)數(shù)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏，在記下各皿的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的2個(gè)平皿的平均菌落數(shù)。

    3.菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告：

    ①平皿菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平皿應(yīng)采用其平均數(shù)，其中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可計(jì)算半個(gè)平皿后乘2以代表全皿菌落數(shù)。

②稀釋度的選擇：　

a.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表例1)。

b.若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)之菌落數(shù)均在30～300之間，則應(yīng)視二者之比如何來(lái)決定，若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)：若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字(見(jiàn)表例2及3)。

c.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度zui高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表例4)

d.若所有釋稀度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表例5)。

e.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以zui接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表例6)。

    f.若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于(＜)1乘以zui低稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表例7)。

　　   　　　　　　　　　　細(xì)菌菌落總數(shù)計(jì)算方法（SPC法）

③菌落數(shù)的報(bào)告：菌落數(shù)小于10，按＜10報(bào)告；在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示。

    三、大腸菌群檢驗(yàn)：

    大腸菌群系指一群在36±1℃24h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧G-無(wú)芽孢桿菌，包括埃希氏大腸桿菌、克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌和檸檬酸桿菌等。該菌群主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)水質(zhì)的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。

水中大腸菌群數(shù)系以每1L水樣中大腸菌群zui近似數(shù)(M.P.N)個(gè)表示。

瓶裝水、飲用水、水源水和游泳池水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

1. 生活飲用水或食品廠生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)：

（1）初步發(fā)酵試驗(yàn)

在2個(gè)各裝有50mL 叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入100 mL水樣，將10支含有5mL叁倍乳糖蛋白胨發(fā)酵管中各加入10mL水樣，于36±1℃培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至48h。若水質(zhì)條件變化不大的飲用水（或生產(chǎn)用水）可采用3個(gè)裝有50mL 叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管分別加入100mL 水樣。

  （2）分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美蘭瓊脂平板，置36±1℃培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，凡菌落或菌苔符合深紫黑色，有金屬光澤；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；淡紫紅色，中心顏色較深或紫紅色菌落特征的均應(yīng)進(jìn)一步作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。

  （3）證實(shí)試驗(yàn)

在上述平板上，挑取在此平板生長(zhǎng)符合上述特征的菌落，或可疑無(wú)法判斷的菌落1～2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性；如乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色陽(yáng)性，則報(bào)告為大腸菌群陰性。

（4）根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查下列表。

飲用水大腸菌群檢索表（接種水樣總量300mL，其中100mL2份，10mL10份）

大腸菌群變異不大的飲用水檢索表

2．池水、河水或湖水等水源水的檢驗(yàn)

將水樣稀釋成10-1、10-2。分別吸取1mL的 10-1、10-2的稀釋水樣和1mL原水樣，各注入裝有10mL單料乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，另取10mL原水樣注入裝有5mL叁倍十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中（接種水量為11.11mL，若水源水嚴(yán)重污染則取樣量應(yīng)為1.111mL，即原水樣、10-1、10-2、10-3；若污染輕度水取樣為111.1mL，即100倍原水樣、10倍原水樣、原水樣和10-1）。置36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況，若有產(chǎn)氣者則按上述的分離培養(yǎng)與證實(shí)試驗(yàn)進(jìn)行，zui后根據(jù)產(chǎn)氣管數(shù)查表報(bào)告。

四、培養(yǎng)基配方

（1）生理鹽水　　　　NaCl　　9g      水　1000mL

（2）伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB）

蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基　　100mL （蛋白胨　10g　NaCl  5g  瓊脂20g       水1000mL  pH7.6  121℃20min）

　　乳糖　2g　　2%伊紅液　2mL　　0.65%美蘭液　1mL　

將已滅菌的蛋白胨水瓊脂溶化，冷卻至60℃左右時(shí)，按無(wú)菌操作加入乳糖、伊紅液和美蘭液（這三種應(yīng)分別在115℃滅菌20min），搖勻后倒平板。

（3）乳糖發(fā)酵液（供復(fù)發(fā)酵用）

　　蛋白胨　10g　　乳糖　5g　　NaCl  5g  　水　1000mL　  pH7.4

1. 營(yíng)養(yǎng)瓊脂

蛋白胨　10g　　牛肉膏　3g　　NaCl  5g　　瓊脂　20g  水　1000mL 　 pH7.0-7.2　　121℃　20min。

（5）單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：

蛋白胨　10g　　　牛肉膏　　3g　　　乳糖　　5 g　　　NaCl   5g

1.6%溴甲酚紫乙醇液　　1mL  　　　十二烷基硫酸鈉　0.1g

　　水　　1000mL　　pH7.2～7.4

將上述除指示劑外溶于水，調(diào)pH7.2～7.4，再加入指示劑。

（6）叁料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：

按單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方要求各營(yíng)養(yǎng)成分為叁倍，而加水不變。

水源水大腸菌群檢索表

接種水量11.11mL，分別為10、1、0.1 和0.01mL各1份

若接種水量為111.1mL則上述數(shù)字減少10倍，若接種水量為1.111mL則上述數(shù)字增加1