幾種核酸雜交技術(shù)的比較 點雜交實驗原理、步驟

本文主要簡單闡述了southern雜交、Northern雜交、原位雜交、點雜交這幾種核酸雜交方法的異同點。并介紹了點雜交的基本概念及實驗原理、方法。

幾種核酸雜交技術(shù)的比較 點雜交實驗原理、步驟
幾種核酸雜交技術(shù)的比較  點雜交實驗原理、步驟

（1）幾種核酸雜交的異同點

核酸雜交是分子生物學的基本技術(shù)，也是遺傳學研究和基因診斷的常用方法。核酸雜交的形式有多種，其中zui常用的是Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、點雜交等。雖然形式多樣，但都是基于核酸分子的堿基互補原理。從雜交材料來看，雜交分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交。從雜交分子狀態(tài)來看，雜交分為液相-固相雜交和液相-液相雜交。

上述幾種雜交都屬于液相-固相雜交，即將參與雜交的一方分子固定在固相的支持載體上，另一方分子以液相形式參與雜交。參與雜交的雙方分子必有一方被標記，以便產(chǎn)生能夠被檢出的雜交信號;在液相-固相雜交中往往液相分子被標記，這樣才能產(chǎn)生有意義的差別信號。在雜交在中，被標記的分子稱為探針，而與探針進行雜交的分子稱為被檢測樣品(被檢分子)。大多數(shù)液相-固相雜交中被檢樣品往往是混合分子，如提取的基因組DNA或某種組織的RNA，并且將被檢樣品固定在載體上，而探針往往是單一分子，如某一基因的片斷。雜交結(jié)果是根據(jù)信號的強弱和位置進行判斷，如被檢分子的分子量(或長度)，被檢分子的表達強度等。這種雜交適用于相同基因片斷對不同樣品的檢測。若進行一種樣品被不同基因片斷的檢測時，就必須采取反向的方式，即將不同的基因片斷固定在載體上，而將被檢樣品制成液相并進行標記。這種反向的方式稱為反向雜交，反向雜交中被標記的樣品也可以稱為探針。

在液相-固相雜交中固相載體往往采用尼龍膜或醋酸纖維膜，這些經(jīng)過特殊處理的材料對核酸分子具有強大的吸附力，在操作中不易脫落。探針標記往往采用放射性標記，如32P、35S等，由于放射性物質(zhì)的危害性，現(xiàn)在非放射性標記也在廣泛使用，如生物素標記、標記等。一般來說，放射性標記適用于Southern雜交、Northern雜交和點雜交，非放射性標記適用于原位雜交。放射性標記靈敏度高，線形范圍寬，非放射性標記定位性強，沒有衰變，危害小。

（2）點雜交的概念

點雜交(dot blot)是雜交信號呈現(xiàn)斑點樣的雜交方法，在操作上是把參與雜交的一方分子點樣到膜上。由于雜交分子預先沒有進行像Southern雜交和Northern雜交之前的電泳分離，也沒有像原位雜交那樣，雜交一方的分子已經(jīng)表現(xiàn)出組織細胞分布的位置特異性，所以點雜交的結(jié)果判斷*視雜交信號的強弱，其信息量沒有其它雜交形式的信息量豐富。但點雜交的操作比較簡單、結(jié)果直觀、適用于大批樣品的檢測，因此它在許多方面也得到了廣泛的應用。

一、實驗目的

理解核酸雜交原理;熟悉核酸雜交的一般方法，掌握膜斑點雜交技術(shù)和結(jié)果分析。

二、實驗原理

點雜交是核酸雜交中比較簡單的一種技術(shù)，本質(zhì)上也是單鏈核酸分子通過堿基互補而形成雙鏈核酸的過程，當某單鏈分子被標記后，就可以檢測與其互補的分子。

(一)印跡

印跡(blot)就是將雜交一方的分子固定在膜上，對于Southern雜交和Northern雜交，往往采用毛細轉(zhuǎn)移，真空轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)移等方法，使電泳分離的核酸分子“原位印跡”到膜上去，而點雜交則可采取人工點樣的方法，將核酸分子固定到膜上去。在點膜時還要借助其它使核酸分子固定的方法(如點膜器、真空抽氣裝置)使分子更緊密地結(jié)合在膜上，并且不擴散。點雜交的印跡過程提供了一個固化平臺和陣列，使雜交在已知位置上進行。

(二)標記

標記(labeling)就是使參與雜交的一方分子帶有可識別的物質(zhì)，使雜交后顯示信號。常用標記物有放射性同位素和非放射性物質(zhì)，標記方法有隨機引物標記法、缺口平移法和末端標記法等。在液相-固相雜交中，標記往往在液相分子上，使探針成為流動相。標記效率是影響雜交的重要因素，在一定范圍內(nèi)，比活性(可以理解為單位分子中的標記物數(shù)量與活性)越高越好。在雜交中，探針往往是過量的(雜交信號的強弱反映的是被檢樣品的量和基因豐度)，所以依靠增加探針量來提高雜交靈敏度的做法很有限的，應該提高探針的比活性。