單核苷酸多態(tài)性（SNP）實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法原理    SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計(jì)，在人類基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP，無論是比較于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析還是微衛(wèi)星標(biāo)記(STR)，都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的zui小單位,據(jù)估計(jì)，人類的所有群體中大約存在一千萬個(gè)SNP位點(diǎn)。一般認(rèn)為，相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)稱作單體型（haplotype）。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見的單體型（每個(gè)具有至少5%的頻率），它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但是我們一旦掌握了這個(gè)區(qū)域的單體型，就可以只使用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs(tagSNP)來進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。
實(shí)驗(yàn)材料    組織樣品
試劑、試劑盒    液氮PBSGA緩沖液GB緩沖液蛋白酶K無水乙醇蛋白液漂洗液
儀器、耗材    離心管離心機(jī)廢液收集管吸附柱水浴鍋分光光度計(jì)低溫冰箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、DNA抽提
 
1.  取新鮮肌肉組織約100 mg，PBS漂洗干凈，置于1.5 ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
 
2.  加200 μl 緩沖液GA，震蕩至*懸浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混勻。
 
3.  加220 μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化，溶液變清亮。加220 μl 無水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
 
4.  將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 
5.  加入500 μl 去蛋白液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
 
6.  加入700 μl 漂洗液GW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12 000 rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。
 
7.  將吸附柱CB 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，加入100 μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應(yīng)在60-70℃水浴預(yù)熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50 μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12 000 rpm 離心30 秒。
 
8.  采用Beckman DU 640 spectrophotometer 檢測(cè)提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時(shí)檢測(cè)純度，OD260/280 的值應(yīng)為為1.7-1.9。
 
9.  從原液中取出相應(yīng)體積DNA 溶液，稀釋致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。
 
二、 PCR擴(kuò)增目的片段 
 
1.  按相關(guān)的試劑說明在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)管中準(zhǔn)備反應(yīng)體系，典型的PCR反應(yīng)體系如下（20 ul體系）：

 
2.  向左扳動(dòng)儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應(yīng)樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。
 
三、 在T1型PCR儀上編輯一個(gè)程序 
 
1.  按[C programs]進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng)建一個(gè)程序請(qǐng)按[D enter]。要進(jìn)入一個(gè)子目錄，用→鍵將光標(biāo)向右移動(dòng)，然后用↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄。按[D enter]進(jìn)入選擇的子目錄。
 
2.  輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認(rèn)溫度。為其輸入時(shí)間，用小數(shù)點(diǎn)來間隔。順序?yàn)閔.m.s。用[D enter]確認(rèn)時(shí)間設(shè)置，或者用光標(biāo)鍵移動(dòng)到下一個(gè)區(qū)域。＃表示循環(huán)的次數(shù)。設(shè)定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數(shù)為30時(shí)應(yīng)輸入“29”。用[C pgm ok]來儲(chǔ)存一個(gè)完整的程序。程序數(shù)據(jù)*的儲(chǔ)存在記憶中。
 
四、運(yùn)行程序 
 
按[B start/stop]選擇一個(gè)程序。用→↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄，或者用[D enter]進(jìn)入主目錄。輸入您想要啟動(dòng)的程序的號(hào)碼?；蛘?，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個(gè)程序。用↑↓鍵在列表中滾動(dòng)選擇。用[D enter]確認(rèn)用強(qiáng)光突出的程序。按[D start]啟動(dòng)程序。
 
五、控制測(cè)試過程 
 
運(yùn)行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時(shí)間信息。運(yùn)行完成后，按STOP按鈕終止實(shí)驗(yàn)，按YES確認(rèn)終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實(shí)驗(yàn)樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
 
六、 PCR產(chǎn)物測(cè)序 
 
由專門負(fù)責(zé)測(cè)序的服務(wù)公司完成。
 
七、數(shù)據(jù)分析 
 
少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對(duì)發(fā)現(xiàn)的SNP在基因組中的位置：重點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)域（包括編碼區(qū)的cSNP及5’及3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導(dǎo)致氨基酸的改變：錯(cuò)義突變、無義突變、終止突變。
 
 
 
 
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  為保證待測(cè)目的區(qū)域測(cè)序真實(shí)可靠，引物設(shè)計(jì)應(yīng)該使待測(cè)目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各50 bp；
 
2.   引物設(shè)計(jì)建議使用在線方式，以保證成功率；
 
3.  為保證測(cè)序敏感性，PCR產(chǎn)物片段大小應(yīng)在250 bp－650 bp范圍；
 
4.  為方便實(shí)驗(yàn)，建議引物合成時(shí)分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測(cè)序的引物分開；
 
5.  為保證引物的特異性，建議引物設(shè)計(jì)后在NCBI上blast確認(rèn)；
 
6.  為防止降解，PCR產(chǎn)物應(yīng)盡快測(cè)序，否則應(yīng)該保存在-20℃，且時(shí)間不宜過長(zhǎng)；
 
7.  為保證結(jié)果真實(shí)性，建議對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行反向測(cè)序確認(rèn)。