警惕化學藥物篩選中的假陽性藥物

新藥開發(fā)領域炙手可熱，大量研究人員蜂擁涌入。但是，當中很多人缺乏應有的引導，科研也做成了一團漿糊。每當生物學家們發(fā)現(xiàn)一個與疾病相關的靶點蛋白，他們就會想方設法尋找能夠與這個蛋白質(zhì)分子結合并影響其活性的化合物，這些有苗頭的化合物常被稱為“活性化合物”。一次典型的藥物篩選流程能夠找到數(shù)千種活性化合物，它們可以作為疾病機理研究的工具，也是尋找新藥的基礎。 但是，在篩選試驗中，很多化合物展現(xiàn)出來的“活性”僅僅是一種假陽性結果——它們的“活性”并不是基于化合物分子與蛋白質(zhì)之間特異性的作用。真正的藥物能夠作用于特定蛋白質(zhì)的結合位點，從而抑制或激活蛋白質(zhì)的功能。而“假陽性化合物”則偽裝成藥物結合的樣子，在各種篩選研究中大放顏霧彈。 
科學家們把這些壞家伙叫做pan-assay interference compounds（泛篩選干擾化合物），簡稱PAINS（這個縮寫可謂物如其名，它們真是研究人員的心頭痛）。PAINS有著明確的化學結構，橫跨多個化合物種類。但是，很多生物學家和缺乏經(jīng)驗的化學家都不能一眼認出它們。相反，經(jīng)常有研究論文把它們錯當成有潛力的“藥物候補”。為了優(yōu)化PAINS的活性，大把時間和研究經(jīng)費都打了水漂?；瘜W家們耗費精力制作出各種類似物，試圖提高PAINS和蛋白質(zhì)之間的“結合性”。 
十年前，藥物篩選工作主要由各大制藥公司完成，這些公司往往有經(jīng)驗豐富的化學家提供。而現(xiàn)如今，越來越多的學術機構也開始進行藥物篩選，同樣水準的卻未必存在。一個例子就是成立于2012年的學術藥物開發(fā)聯(lián)盟（Academic Drug Discovery Consortium），該機構目前已在9個國家成立了超過115家研發(fā)中心，并頗引以為豪。但是，學術機構中越來越多的藥物研究人員缺乏相應的訓練，無法區(qū)分“活性化合物”中何為良何為莠，何為搗蛋分子。 
PAINS在篩選試驗中表現(xiàn)出的“活性”誘惑力，于是出現(xiàn)了這種現(xiàn)象：即使已經(jīng)有論文發(fā)表指出某種化合物會干擾篩選結果，關于該化合物的“活性”研究仍會繼續(xù)。例如，2013年的一項研究發(fā)現(xiàn)了七種在篩選時能夠與超過三分之一蛋白質(zhì)發(fā)生作用的干擾化合物，但是這篇論文并未得到應有的關注。 
像這樣對多種蛋白質(zhì)有反應、看上去大有前景的干擾化合物被研究人員們反復報道，相關數(shù)據(jù)充斥著整個化學界文獻庫。這些論文再三將假陽性分子錯認為有效的新藥，帶動一輪又一輪的“篩選-發(fā)表-窮折騰”的惡性循環(huán)。藥劑公司將這些假陽性化合物放進產(chǎn)品目錄，號稱是有發(fā)表論文支持的蛋白質(zhì)抑制劑，導致其他生物學家也開始在自己的研究中使用這些化合物。 

造成篩選假陽性的“罪犯”們 

盡管PAINS常被叫作“壞反應物（bad actors）”，但它們其實是相當?shù)摹把輪T”：在假裝自己“有潛力“方面簡直堪稱！喬納森.貝爾（Jonathan Baell，也是本文作者之一）在自己的實驗室因為假陽性物質(zhì)白白浪費了兩年后，于2010年發(fā)表了一篇關于識別PAINS的指南。而另外一位作者邁克爾.沃爾特斯（Michael A. Walters）在為一種試驗中的殺真菌劑準備說明書和申請時，發(fā)現(xiàn)了很多名不副實的“活性“化合物，于是也開始了反PAINS的宣傳之路。一個簡單的例子就能說明PAINS為科研帶來的危害：研究人員發(fā)現(xiàn)了一些能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性作用的化合物，于是就花費了一年多的時間試圖弄清個中機理，他們試遍各種方法，包括蛋白質(zhì)聚集、化學分解、反應活性檢驗以及熒光測定，zui終卻沒有收獲。根據(jù)我們的估計，只要提高對PAINS的認識外加一些預防措施，就能避免無用功，為生物醫(yī)學研究工作節(jié)省數(shù)年的時間以及數(shù)百萬美元的研究經(jīng)費。 
海市蜃樓 
一個典型的學術藥物篩選數(shù)據(jù)庫中往往有5~12%的化合物屬于PAINS，而且這些冒牌貨還能被重復實驗驗證。大部分實驗室青睞的“標配”數(shù)據(jù)庫情況相似，例如試劑公司Sigma-Aldrich提供的藥理活性化合物數(shù)據(jù)庫（LOPAC），以及美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）提供的分子庫-小分子存儲項目（MLSMR）。 
大多數(shù)PAINS僅僅是有反應活性的化學物質(zhì)，而非真正具有特異性的藥物候選。它們用以瞞天過海的方法五花八門。有的PAINS能發(fā)出熒光或是自己有顏色，即使目標蛋白不存在時也能夠表現(xiàn)出陽性反應。還有一些PAINS能捕獲篩選實驗中被用作試劑或反應物的金屬元素，使得后者引發(fā)陽性反應，盡管這種反應與蛋白質(zhì)本身沒有半點關系。另外一些PAINS能夠附著在蛋白質(zhì)表面，或是與蛋白質(zhì)功能相關的金屬離子螯合，亦或是通過特異性結合以外的方法改變蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)。在發(fā)現(xiàn)具有藥物潛力的化合物后，研究者們會想方設法調(diào)整它們的分子結構，以提升其效果（這項手藝俗稱“藥物化學”），而前面提到的這些無疑會阻礙進一步的開發(fā)與研究。 
因為不具特異性，PAINS的往往能夠作用于多種蛋白。例如，在特定篩選條件下，一些分子會產(chǎn)生過氧化氫，而過氧化氫能夠使目標蛋白失活，從zui終結果看來這些化合物活像蛋白質(zhì)抑制劑。但事實上，它們并沒有與目標蛋白結合。 
新的活性化合物被篩選出來后，下一步往往要在細胞中進行檢驗。在這一階段，PAINS同樣有多種花招擾亂人們的視線。它們能夠讓細胞表現(xiàn)出預期中的結果（譬如生長抑制），背地里的機制卻*是另外一套。研究人員總是盲目樂觀，愿意相信自己手頭的化合物有潛力與某種目標蛋白發(fā)生反應。他們從藥劑供應商那里買來類似的化合物，隨后又花費大量經(jīng)費和資源，制造出更多的類似物并一一檢驗。 有些化合物甚至要等到申請或動物實驗后才露出馬腳。令人遺憾的是，從動物試驗中也可能得出與預期機理毫無關系的誤導性結果。
相反，真的活性化合物——也就是能夠與選定的目標蛋白質(zhì)發(fā)生特異性作用的分子——在細胞實驗中往往一開始并不能表現(xiàn)出活性，只有在修飾過分子結構，使之與蛋白質(zhì)結合效率提升或是更容易進入細胞后，它們才顯現(xiàn)出真正的實力。 
研究者zui需要警惕的化合物包括毒黃素，以及多羥基的植物化學成分，例如姜黃素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、染料木黃酮和白藜蘆醇。盡管前人的研究已經(jīng)全面揭發(fā)了這些化合物及其類似物節(jié)操喪失的本質(zhì)，但仍有*的新研究將之用作實驗性新藥和“陽性”控制組。 
要想知道問題的嚴重性，繞丹寧（rhodanines）就是一個很好的例子。搜索文獻庫可以發(fā)現(xiàn)，有410篇論文聲稱繞丹寧具有生物活性，涉及的繞丹寧類化合物多達2132種，這些論文的作者來自290家研究機構，其中只有24家是商業(yè)公司。這些論文往往將繞丹寧鼓吹為前景光明的藥物開發(fā)對象。藥劑公司Bristol-Myers Squibb發(fā)表的一篇論文警告研究者們，這種類型的化合物會發(fā)生光誘導反應，從而不可逆地改變蛋白質(zhì)結構，這是為數(shù)不多冷靜的聲音。作用機制既然如此，就很難想象這種物質(zhì)能夠成為藥物或者有用的研究工具。但是，在那些假定繞丹寧具有活性的論文中，卻幾乎無人引用這項研究。 
偶爾有一些PAINS化合物的確能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性的反應。這些化合物可以通過藥物化學的方法修飾結構、優(yōu)化性能。然而即便如此，PAINS的前景依舊堪憂——作用結果到底是特異性的“藥效“作用，還是有其他什么貓膩很難區(qū)分。跟繞丹寧有關的多達280項，這說明繞丹寧已經(jīng)被選拔為下一步藥物研發(fā)的目標。但是，還沒有任何篩選出來的繞丹寧化合物進入了臨床使用，甚至連臨床試驗的苗頭都沒有。因此，繞丹寧相關的申請和維護都屬于資金浪費，更別提背后的海量研究工作了。 
學術期刊《藥物化學（Journal of Medicinal Chemistry）》近期開展了一項提議，鼓勵投稿人在稿件中附上可被軟件識別的分子結構文件，從而可以方便地實現(xiàn)化合物可靠性的自動審查。這帶來的好處有很多，其中之一就是能夠幫助編輯和審稿人排除PAINS相關的投稿。我們也建議曾經(jīng)發(fā)表過論文、把PAINS描述為潛力化合物的研究人員提供后續(xù)實驗數(shù)據(jù)，證實這些化合物的假陽性性質(zhì)。給PAINS貼上標簽能大大減少無用功，也能防止藥劑銷售商繼續(xù)把它們賣給蒙在鼓里的生物學家們。 
zui重要的是，藥物研發(fā)人員應當提高警惕。在藥物篩選試驗中表現(xiàn)出zui強活性的化合物未必是zui合適的研究對象。即便是訓練有素的藥物化學家也不能大意，而應努力積累篩選經(jīng)驗。千萬別走進PAINS這條騙人的死胡同。 
相關資料： http://www.nature。。ｃｏｍ/news/chemistry-chemical-con-artists-foil-drug-discovery-1.15991                    轉(zhuǎn)自丁香園