抗壞血酸含量的測定

實(shí)驗(yàn)原理

還原型抗壞血酸（AsA）可以把鐵離子還原成亞鐵離子，亞鐵離子與紅菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反應(yīng)，形成紅色螯合物，對(duì)534nm波長的吸收值與AsA含量正相關(guān)，故可用比色法測定。脫氫抗壞血酸（DAsA）可由二硫蘇糖醇（DTT）還原成AsA；測定AsA總量，從中減去還原型AsA即為DAsA含量。

實(shí)驗(yàn)試劑

5%三lv乙酸（TCA）；20%TCA；無水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液；0.6g/L DTT；Na2HPO4－NaOH溶液：以0.2mol/L Na2HPO4和1.2mol/L NaOH等量混合；60mmol/L DTT－乙醇。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

離心機(jī)；分光光度計(jì)；研缽；試管。

實(shí)驗(yàn)材料

受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。

實(shí)驗(yàn)步驟

    1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線  配制濃度為2，4，6，8，10，12，14mg/L的AsA系列標(biāo)準(zhǔn)液。各取1.0ml于試管中，加入1.0ml 5%TCA，1.0ml乙醇，搖勻。再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4－乙醇，1.0ml 0.5%BP－乙醇，0.5ml 0.03% FeCl3－乙醇，總體積5.0ml。將溶液置于30℃下反應(yīng)90min，然后測定A534。以AsA濃度為橫坐標(biāo)，以A534為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程。

    2. 提取  取植物葉片1.0g，按1︰5（W/V）加入5%TCA研磨，離心（4000×g）10min，上清液供測定。

    3. 測定

    AsA測定  取1.0ml樣品提取液于試管中，按上述測標(biāo)準(zhǔn)液相同的方法進(jìn)行測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AsA含量。

    DAsA測定  向1.0ml樣品液中加入0.5ml 60mmol/L DTT－乙醇溶液，用Na2HPO4－NaOH混合液，將溶液pH調(diào)至7~8。置于室溫下10min，使DAsA還原。然后加入0.5ml 20%TCA，把pH調(diào)至1～2。按AsA相同方法進(jìn)行測定，計(jì)算出總AsA含量，從中減去AsA即得DAsA含量。