酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELIspot）

煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶抗體實(shí)驗(yàn)方法原理    ELISPOT技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)。
實(shí)驗(yàn)材料    細(xì)胞
試劑、試劑盒    PBS PBST乙醇包被抗體 封閉液 抗體稀釋液 檢測(cè)抗體 酶聯(lián)親和素 AEC顯色液PHA刺激物 U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基
儀器、耗材    ELISPOT讀數(shù)儀 超凈工作臺(tái) 細(xì)胞培養(yǎng)箱 移液器 槍頭 離心管ELISPOT板
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、ELISPOT包被 
 
1.  設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)，把每個(gè)孔要加入的內(nèi)容做成卡片，到時(shí)候就會(huì)從容很多。
 
2.  每孔加入15 μL 70%的乙醇預(yù)濕30秒。
 
3.  加入100 μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。
 
4.  按照試劑盒的使用說(shuō)明，將包被抗體儲(chǔ)存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50 μL，4°C包被。
 
5.  （次日）傾倒包被液，用PBS洗滌5次，zui后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。
 
6.  加入200 μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時(shí)。
 
7.  傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數(shù)周。）
 
二、鋪細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng) 
 
整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一組正對(duì)照（PHA刺激），每一個(gè)細(xì)胞樣品（同一個(gè)捐獻(xiàn)者或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照（不加刺激物），整塊板還要加一個(gè)背景負(fù)對(duì)照（不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑）。
 
1.  填好實(shí)驗(yàn)卡片，用以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安排和細(xì)胞及試劑的添加。每一個(gè)細(xì)胞/刺激物的組合設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)（想要有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，每個(gè)細(xì)胞/刺激物設(shè)4個(gè)孔的重復(fù)）。
 
2.  取出封閉好的板，準(zhǔn)備加入細(xì)胞。如果是以前做的封閉，可以加入200 μL的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次。
 
3.  按照實(shí)驗(yàn)卡片的安排，加入不同濃度的細(xì)胞，100 μL/well，細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細(xì)胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認(rèn)為拍擊板子會(huì)讓細(xì)胞更分散，實(shí)際情況剛好相反）。正對(duì)照的細(xì)胞濃度為1x105/well，實(shí)驗(yàn)組的樣品細(xì)胞濃度請(qǐng)自行調(diào)整。
 
4.  加入100 μL的U-Cytech無(wú)血清培養(yǎng)基到背景負(fù)對(duì)照孔。
 
5.  正對(duì)照孔加入10 μL PHA，終濃度4 ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。
 
6.  加入實(shí)驗(yàn)者自己的刺激物（配制成10×終濃度，10μL/well）到實(shí)驗(yàn)孔。加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。
 
7.當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。
 
三、培養(yǎng)后操作 
 
1.  傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。
 
2.低滲法將細(xì)胞裂解，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。
 
3.每孔用200 μLPBST洗滌10遍，洗滌zui后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
4.按照試劑盒說(shuō)明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測(cè)抗體，每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37°C1小時(shí)。
 
5.  每孔用200 μL PBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
6.  按照試劑盒說(shuō)明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素，每孔加入100 μL，37°C1小時(shí)。
 
7.  每孔用200 μLPBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
8.  照試劑盒的說(shuō)明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。
 
9.  待斑點(diǎn)生長(zhǎng)到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂。
 
10.  將ELISPPOT板置于ELISPOT自動(dòng)讀數(shù)儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，半點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析。
 
煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶抗體注意事項(xiàng)    
一、ELISPOT包被 
 
1.  未潤(rùn)濕的PVDF膜是潔白的、不透明的，經(jīng)過(guò)乙醇潤(rùn)濕之后，顏色變暗，變成半透明狀，很容易觀察二者的區(qū)別。
 
2.  加乙醇的時(shí)候，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜。
 
3. 有時(shí)候，加入的乙醇掛在孔壁上，這時(shí)要蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢(shì)滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會(huì)在表面張力和毛細(xì)作用之下迅速浸潤(rùn)整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。
 
4.15 μL是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的體積，它能保證剛好*浸潤(rùn)整塊膜，而不會(huì)有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就會(huì)透過(guò)膜而積存在膜的背面，加深實(shí)驗(yàn)的背景。
 
二、鋪細(xì)胞，加入刺激物，培養(yǎng) 
 
當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)。注意在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中避免移動(dòng)、碰撞培養(yǎng)板。為了取得更好的結(jié)果，甚至開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱的箱門也應(yīng)該禁止。因?yàn)榕鲎矔?huì)造成細(xì)胞的移位，造成斑點(diǎn)的模糊、拖尾。
 
三、培養(yǎng)后操作 
 
洗滌膜的背面，在一個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。注意，一定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜。