免疫血清的制備實驗

白介素2受體（IL-2R）免疫組化檢測試劑盒實驗方法原理    具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應答的規(guī)律性，現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應答特點截然不同。這是由于記憶性B細胞參與再次應答所致。
實驗材料    家兔
試劑、試劑盒    滅菌生理鹽水IgG酒精碘酒羊毛脂石蠟油BCGFIAFCA-IgG
儀器、耗材    剪刀鑷子注射器針頭稱量瓶量筒動物固定架三角燒瓶手術器械血管夾黑絲線放血管
白介素2受體（IL-2R）免疫組化檢測試劑盒實驗步驟    
一、免疫方法 

根據(jù)抗原的性質不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。

1.  用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚。

2.  *次免疫

用2 ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA IgG液1 ml，每側腳掌皮下各注入0.5 ml。

3.  第二次免疫

間隔10-14 天后，于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入FCA-IgG，每個淋巴結注0.1 ml，其余注入淋巴結附近皮下共1 ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側窩及鼠蹊部皮下。

4.  間隔7-10 天后，從耳靜脈采血0.5～1.0 ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價（即試血）。效價至少應達到1∶16以上時才能放血。

5.  若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內注射免疫。即于1 周內注射3 次，分別為0.1、0.3、0.5 ml。間隔1 周再試血。如效價達到要求應立即放血。另外，也可在第2 次免疫后，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA-IgG）再免疫1-2 次。注射部位、劑量和間隔均同第2 次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。

二、放血 

1.  心臟采用血法

（1）家兔仰面，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。

（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚。

（3）用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動zui強的部位。

（4）用50 ml注射器（連接16號針頭），傾針45°角度，對準心搏zui強處刺入心臟抽血致死。

（5）將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。

2.  頸動脈放血法

（1）家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚。

（2）沿頸部中線切開皮膚約10 cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突肌。

（3）分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離。

（4）于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住。

（5）用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。

（6）松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100 ml。

三、分離血清 
 
將三角燒瓶的血置37 ℃溫箱1 小時，再置4 ℃冰箱內3～4 小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000 rpm離心15 分鐘，取上清加入防腐劑（0.01 ％硫柳汞或0.02 ％疊氮鈉，zui終濃度），分裝后置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>收起 
注意事項    
1.  免疫用實驗動物的抗體反應性個體差異性較大，因此免疫時至少應選用兩只以上動物。另外，不能使用妊娠動物。

2.  免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費時、費力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900 轉/分，振幅6 mm）；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內再將注射器連接于三腔管上反復抽吸研磨。這兩種方法約1 小時即可使抗原充分乳化。 
 
3.  佐劑一方面可提高特異性免疫反應的效果獲得價的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的污染物（0.005 mgN）產(chǎn)生抗體，以致導致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實驗動物種系對BCG過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當再次注射*佐劑時，可以引起變態(tài)反應而導致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時應減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑，以減少和防止變態(tài)反應的發(fā)生。 
 
4.  抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多?？乖挠昧恳话阋泽w重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5 mg/kg體重為宜。如不加佐劑時劑量可加大10 倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。 
 
5.  免疫方法上也可采用多點注射法免疫動物。即于家兔脊柱兩旁選4-6 點皮下注射，同時于兩側肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處。每點注0.2 ml，間隔2 周后再于上述部位選不同點同上注射，也可產(chǎn)生價的免疫血清。
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其他    
一、結果鑒定

以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質量，應產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關部分。