交叉保護(hù)中和實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)材料    毒株標(biāo)準(zhǔn)血清
試劑、試劑盒    牛血清Hanks 氏液瓊脂糖
儀器、耗材    水浴鍋24孔板孵箱
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、試驗(yàn)?zāi)康?nbsp;

血清分型。

二、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 
 
1.  標(biāo)本

出血熱恢復(fù)期病人血清

2.  材料
 
（1） 毒株 漢灘病毒標(biāo)準(zhǔn)株 76-118，漢城病毒標(biāo)準(zhǔn)株 Seoul；
 
（2）標(biāo)準(zhǔn)血清 兔抗?jié)h灘病毒、漢城病毒血清；
 
（3）空斑減少中和試驗(yàn)常用試劑。
 
三、步驟 
 
1.  將待檢血清用牛血清Hanks 氏液稀釋成1：10，56℃滅活30分鐘；
 
2.  進(jìn)一步2倍稀釋血清成1：20、1：40、1：80……，對(duì)照血清1：10稀釋；
 
3.  稀釋兩種病毒（在冰浴中進(jìn)行）至含200 pfu/ml；
 
4.  各連續(xù)稀釋度血清分別與200 pfu/ml的兩種病毒液等量混合（各0.3 ml），置37℃中作用1小時(shí)（每15分鐘振蕩一次）；
 
5.  吸出各細(xì)胞培養(yǎng)孔中維持液；
 
6.  接種長滿單層的Vero-E6細(xì)胞（24孔板），每孔接種血清病毒混合液、標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照及兩種病毒對(duì)照 ，每稀釋度兩孔，100 ul/孔。37℃吸附1小時(shí)，每隔15分鐘搖動(dòng)一次；
 
7.  加*層瓊脂糖覆蓋液（需冷置42℃左右），每孔1 ml，室溫下待凝固，細(xì)胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)7-9天；
 
8.  加第二層含中性紅瓊脂糖覆蓋液，1 ml/孔，室溫下待凝固，細(xì)胞面朝上，置37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)2-5天，從第二天開始觀察空斑數(shù)；
 
9.  抗體滴度的判定，以比病毒對(duì)照的空斑數(shù)中和或減少50%的血清zui高稀釋度倒數(shù)判為待檢血清中和抗體滴度；
 
10.  型別判定：根據(jù)同一份血清與兩種病毒的反應(yīng)滴度不同來區(qū)分，如果一份血清與漢灘病毒 （或漢城病毒）反應(yīng)的抗體滴度高于與漢城病毒（漢灘病毒）的抗體滴度4倍或以上，即判為漢灘病毒型，反之則為漢城病毒型。兩者滴度相差無幾時(shí)，則不好分型。不足4倍時(shí)亦不能定型。
 
四、配方 
 
1.  *層瓊脂糖覆蓋液
 
 
 
2.  第二層瓊脂糖覆蓋液 基本上同*層瓊脂糖覆蓋液，僅將滅活胎牛血清改為5 ml，另加中性紅溶液1 ml（333.0 ug/L中性紅鈉鹽Gibco）。