單向定量免疫電泳實驗

實驗方法原理    火箭電泳(rocketimmunoelectrophoresis)又稱單向定量免疫電泳，將抗原樣品放在含有專一性抗體的凝膠孔中，抗體靜電荷為零不移動；而抗原分子在電場作用下移動，形成抗原-抗體復合物沉淀下來。后面的抗原繼續(xù)向正極泳動遇到沉淀的抗原-抗體復合物，抗原過量使復合物沉淀溶解，與未結合的抗體結合，又形成新的抗原-抗體復合物沉淀下來，不斷沉淀-溶解-再沉淀，zui后形成錐形的沉淀峰，稱火箭電泳。其高度與所加抗原的量大致成比例。
（來源：生物化學與分子生物學實驗指導，邵雪玲等，武漢大學出版社，2003）
實驗材料    人IgG 兔抗人IgG
試劑、試劑盒    瓊脂
儀器、耗材    玻璃板 電泳儀 水平電泳槽 打孔器 微量加樣器 恒溫水浴鍋
實驗步驟    
1. 抗體瓊脂板的制備
 
將融化的瓊脂冷卻到55 ℃，加入適量（看免疫血清的效價高低而定）的抗體，立即混勻（不要出現(xiàn)泡沫），將上述的抗體瓊脂（大約20 ml）制成瓊脂板，冷卻后按下圖打孔備用。

 
2. 加樣
 
在各孔里加入按二倍連續(xù)稀釋法稀釋的抗原。
 
3. 電泳
 
通電后調電壓為10 V/cm，或電流強度為2～4 mA/cm，時間約1～5小時。
 
4. 觀察
 
在電場作用下，定量的抗原在含有定量的瓊脂中泳動后，比例合適時，可在短時間內出現(xiàn)錐形沉淀，此沉淀線形似火箭，抗原濃度越高，“火箭”面積愈大。但抗體效價要高。
 
5. 定量抗原

在電泳一定時間后可以觀察到火箭狀的白色沉淀峰。電泳完畢后，測定沉淀峰的高度，用圓規(guī)仔細測量沉淀峰zui與樣品孔中心間的距離，記錄結果。以標準樣品即不同抗原濃度為橫坐標，以沉淀峰的高度為縱坐標繪制標準曲線。根據量得的待測抗原沉淀峰的長度，從標準曲線查出相應抗體含量，在乘以樣品稀釋倍數即可計算出該抗原的含量。
收起 
注意事項    
如果計算，可用求積儀測定峰的面積。影響單向定量免電泳的因素很多，主要是要選擇好抗體濃度，使抗原抗體濃度比例合適。這就需要根據免疫血清的效價來定所加入瓊脂中的抗體量，如效價高，則免疫血清瓊脂的比例為1∶5～9，如效價低；;則免疫血清與瓊脂的比例為2∶5。另外，抗原含量也要注意，過高過低都影響火箭峰形。如抗原含量過低，則峰形太矮，如抗原濃度過高，則火箭峰不封口。如抗原抗體量合適，泳動的距離大約為2～5 cm。