反相色譜法中流動相和溶劑選擇的一些經驗-阿拉丁色譜溶劑

色譜分析中積累了一些經驗，分享給大家： 

1.反相色譜法分析，乙腈和甲醇哪個更好？

甲醇和乙腈是反相色譜法中zui常用的有機溶劑，二者的極性和溶劑強度相差不大，但它們還是有一些差異，在此詳細闡述一下。  

 (1）UV檢測器上的響應值：在紫外區(qū)尤其是遠紫外區(qū)(靠近200 nm)，乙腈的吸收遠低于甲醇，這一區(qū)別產生的影響在等度條件下也許還不明顯，但若使用梯度，乙腈所引起的基線漂移則遠小于甲醇，這樣使用乙腈做流動相，得到的色譜圖不僅美觀，樣品的檢出限也低得多，所以該指標乙腈占優(yōu)；

(2)洗脫強度：乙腈的洗脫能力稍強于甲醇。如果查閱溶劑參數(shù)表，能夠發(fā)現(xiàn)乙腈的極性指數(shù)(5.8)稍高于甲醇(5.1)，受此表啟發(fā)，我曾固執(zhí)地認為在反相色譜法中甲醇與水混合所調出的溶液的洗脫范圍要寬于乙腈，然而實踐證明與水混合時，乙腈的洗脫能力更強，隨著有機相比例的升高，這種區(qū)別逐漸減小，如果是純溶劑二者趨于一致，也就是說，混合水以后乙腈的洗脫能力還是強于甲醇的；但洗脫能力不能用作評價溶劑好壞的標準，不過對于某一項分析，如果用甲醇替代乙腈，相應的有機相比例應調高一些。  

(3)選擇性：二者的選擇性各具特點。色譜分析中的選擇性往往無法給出普遍適用的參數(shù)，這就需要實踐經驗支持。我喜歡進行多組分分析，在某些情況下，使用乙腈-水洗脫分離情況優(yōu)于甲醇-水，比如PAEs、PAHs、酚類化合物等等，選擇乙腈得到了較優(yōu)的分離效果，而甲醇則不行；其他一些應用中，甲醇的選擇性也會優(yōu)于乙腈，比如羰基類化合物-DNPH分析和氟喹諾酮類藥物(沙星類藥物)，其他同行使用了乙腈，化合物并未*分離，我進行分析時改用了甲醇，所有化合物全部分開了。這是由于有機溶劑分子的化學性質（甲醇和乙醇是質子性，乙腈和四氫呋喃是非質子性）不同所致。本人的觀點，如果是多組分分析方法開發(fā)時，用兩種溶劑進行對比，以便得出*條件。  

(4)色譜柱背壓：

柱內承受的壓力,根據(jù)有機溶劑的種類或混合比例的不同而異.
25℃時，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；40℃時，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；

總體而言，使用乙腈時，色譜柱的背壓低于甲醇，原因是乙腈的黏度低于甲醇(25 ℃時，乙腈0.37cp，甲醇0.60cp)。該指標，乙腈占優(yōu)。
綜上所述，反相色譜法中乙腈的效果優(yōu)于甲醇。（不考慮價格） 

2.離子抑制色譜法該選何種試劑？

離子抑制就是向流動相中加入酸或堿，使弱酸或弱堿以單純的未解離形式存在，既能增大其在反相柱上的保留又能得到更的峰形。該方法主要用于弱酸分析(堿性化合物通常不采用離子抑制法）。常用的酸性添加物為磷酸、醋酸、甲酸等。

對比三者的吸光值，磷酸是zui小的（254 nm下約為0.04），乙酸和甲酸相差不大（254 nm下均略低于1.0），這一事實會導致一個問題——在低波長（254 nm以下）下，添加乙酸和甲酸會引起更高的噪聲，這就影響了分析的靈敏度，另外由于磷酸酸性強，達到同一pH值用量更少，所以使用磷酸時噪聲會更低。而在使用緩沖溶液和甲醇或乙腈進行梯度分析時，乙酸或甲酸的存在可能會對乙腈、甲醇的基線漂移起到一定的抵消作用，當然這只是猜測，還有待驗證。 

3.上樣前樣品溶劑的選擇。

的溶劑是流動相。

上面這句話可能很多人都知道，但至于為什么要這樣可能不清楚。原因： 

 (1)流動相作溶劑不會出現(xiàn)溶劑峰。在藥物QC、化學品QC中，主成分和雜質定量是通過歸一化法進行的，溶劑峰的出現(xiàn)會使主成分測定值偏離實際值，所以溶劑峰是必須要消除的，*的辦法就是以與流動相組成嚴格一致的溶劑溶解樣品。如果這樣做還是會出峰，那可能就是不被保留的化合物了；  

(2)反相分析中，如果采用洗脫強度明顯高于流動相的溶劑或溶液進行溶解，往往會導致柱效下降、峰前沿、峰前分叉峰，這種影響對洗脫較快的化合物影響更甚，并且進樣量越大影響越嚴重。原因在于強洗脫樣品溶劑的加入局部增大了流動相的洗脫強度，使單種組分的前部分與后部分的保留性不一致（前部分移動快、后部分移動慢），進而導致區(qū)域展寬。 

 我舉兩個例子：

我分析氯霉素時，流動相為甲醇：水=40：60，氯霉素是用甲醇溶解的，結果塔板數(shù)不足32000/m，后來改用流動相溶解，塔板數(shù)升到了90000/m；還有一次，我分離磺胺類藥物，用的梯度(起點乙腈：乙酸水溶液=12：88)，溶劑為甲醇，結果*個峰分叉了，其余正常。要知道，如果是色譜柱損壞，那么所有的峰形均應分叉。后來改用流動相溶解，一切問題迎刃而解。

我的結論：溶劑的洗脫強度等于流動相，峰形和色譜圖會很；若稍低于流動相，也許會有溶劑峰，但峰形會是的，切勿使溶劑的洗脫強度明顯高于流動相。