Western Blot 操作原理步驟Western Blot 操作

基本原理 【動畫】

    免疫印跡法（immunoblotting test，IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測核酸的印跡方法Southen blot相類似，亦被稱為Western blot。免疫印跡（western blotting）是在蛋白質電泳分離和抗原抗體檢測的基礎上發(fā)展起來一項檢測蛋白質的技術。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應的特異性相結合。
    典型的印跡實驗包括三個步驟：
    ①蛋白質的電泳分離
    ②將電泳后凝膠上的蛋白質轉移至固體膜上，用非特異性，非反應活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質區(qū)域
    ③免疫學檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用zui廣泛的免疫化學方法之一。

免疫印跡法原理示意圖

    *階段為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰酰凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。
    
    第二階段為電轉移。將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。
    
    第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。

    本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗?？乖涬娪巨D移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體。

 

樣本的制備

    幾乎任何蛋白質都可用于免疫印跡。免疫印跡的優(yōu)勢是能分析不能用其他的免疫化學技術進行研究的蛋白質樣品。例如，不能標記的蛋白質或不溶于溫和抽提緩沖液的蛋白質等。免疫印跡還可分析各種組織、器官或微生物等來源的粗制樣品。
    用于免疫印跡的樣本種類繁多，處理的方法也有所不同，為了選擇理想的處理方法，應當考慮細胞的類型和待測抗原的性質。

 細菌表達蛋白質和樣本制備

一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解，具體方法如下：

    [試劑與設備]
    （1）表達待檢測蛋白質的細菌。
    （2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
    （3）2xSDS凝膠加樣緩沖液：
        100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
        200mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）
        4％ SDS（電泳級）
        0.2％ 溴酚藍
        20％ 甘油
    不含有二硫蘇糖醇（DTT）的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前須從1mol／L二硫蘇糖醇儲存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。
    （4）臺式離心機。
    （5）超聲破碎儀。
    （6）水浴箱。
    （7）渦漩振蕩器。
    （8）加樣器與吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）表達靶蛋白大腸桿菌經誘導適當時間后，用微量離心機以12 000g離心30s，收集1ml培養(yǎng)的菌體。
    （2）吸取培養(yǎng)液，加入0.5ml用冰預冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振蕩沉淀的菌體，
使之復懸，用微量離心機于0°C以12000g離心30s回收菌體。
    （3）再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
    （4）加入25μl水，振蕩使沉淀復懸，一旦菌體分散開來，立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液，繼續(xù)振蕩20s。
    （5）樣品在沸水浴中放置5min。
    （6）采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時處理多個樣品的超聲處理儀對DNA進行剪切，根據(jù)所用超聲處理儀的輸出功率及其設定狀態(tài)，以zui大功率處理0.5—2min應能有效地將裂解液粘度降至可控水平；
    （7）樣品于室溫以12000g離心10min，將上清液移至另一管中，棄沉淀物；
    （8）吸取經剪切或超聲處理的樣品25μl電泳，剩余樣品保存于—20~C備用。

 

 快速裂解酵母細胞制備樣本

    使用這種方法會使蛋白質變性，在所用抗體能識別變性靶蛋白時才能使用這一方法。

    [試劑與設備]
    （1）待檢測的酵母菌。
    （2）25％三氯乙酸（TCA）
    （3）1％SDS。
    （4）丙酮。
    （5）RIPA緩沖液：
        50mmol／L Tris—HCl（pH7.5）
        150mmol／L NaCl
        1％ Nonidet P-40 （NP-40）
        0.5％ 去氧膽酸鈉
        0.1％ SDS
    （6）玻璃珠（直徑0.45—0.50mm）。
    （7）臺式離心機。
    （8）水浴箱。
    （9）渦漩振蕩器。
    （10）加樣器與吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）0°C以12000g離心lmin，從lml培養(yǎng)物中收集細胞，棄上清液（當靶細胞為分泌型蛋白時除外）。
    （2）用0．5ml 25％三氯乙酸（TCA）重懸細胞。
    （3）按步驟1離心回收細胞，重懸于1ml 90％丙酮中。
    （4）按步驟（1）離心，估算沉淀物體積，加入等體積1％SDS重新懸浮沉淀物。
    （5）加入經酸處理的玻璃珠（直徑0．45—0．50mm）至溶液的彎月面處。
    （6）振蕩懸液5次，每次間歇期間將懸液置于冰浴中冷卻lmin，在相差顯微鏡下監(jiān)測細胞
    （7）用一燒紅的皮下注射器針頭（23號）在微量離心管的頂蓋上穿一小洞，以防加熱過程中玻璃球沖出離心管。
    （8）在沸水浴中加熱3min。
    （9）把玻璃珠轉移到另一個微量離心管中，用0.5ml RIPA緩沖液洗滌原離心管，并把洗液合并于內裝玻璃珠的管中。
    （10）在微量離心管底部打一小洞，回收細胞提取液，這一操作使用燒紅的皮下注射器針頭效果*。把仍裝載玻璃球的微量離心管置于另一空微量離心管上，把如此重疊的一對微量離心管，于4°C以2000g離心2min。
    （11）回收下面一只內有細胞提取液的微量離心管，于4°C12以2000g離心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一個微量離心管中，—20°C貯存?zhèn)溆谩?br />
    [注意事項]
    酵母細胞提取液儲存于—20°C一般是穩(wěn)定的，但是，如果待測蛋白被水解，則應在提取液中加入蛋白酶抑制劑，并保存于0°C。

哺乳動物細胞和組織的樣本制備 【動畫】

    哺乳動物細胞和組織有單層培養(yǎng)細胞、懸浮培養(yǎng)細胞和組織碎片，雖然均可采用凝膠加樣緩沖液裂解的方法來制備樣本，但制備方法有所差異。
    這里介紹其中兩種方法：①對單層細胞的處理方法 ②對懸浮培養(yǎng)細胞和組織碎片的處理方法

對單層細胞的處理方法

    [試劑與設備]
    （1）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。
    （2）1XSDS凝膠加樣緩沖液（參見“細菌表達蛋白質和樣本制備”）。
    （3）水浴箱。
    （4）吸管、細胞刮棒等。

    [操作步驟]
    （1）用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗細胞2次，棄去洗液并吸凈殘余的PBS液體。
    （2）如直徑為90mm的平皿，則加人100-200μl加熱到85°C的1XSDS凝膠加樣緩沖液溶解細胞，用細胞刮棒把粘稠狀的細胞裂解物收集于一個微量離心管中。

對懸浮培養(yǎng)細胞和組織碎片的處理方法

    [試劑與設備]
    （1）懸浮緩沖液的配制：
        0.1mol／L NaCl
        0.01mol／L Tris—IICI（pH7.6）
        0.001mol／L EDTA（pH 8.0）
        1μl／ml Aprotinin
        100μg／ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
    （2）2XSDS凝膠加樣緩沖液（參見“細菌表達蛋白質和樣本制備”）。
    （3）臺式離心機。
    （4）吸管或真空抽吸裝置。
    （5）加樣器和吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）取1s組織或109細胞，加lml冰預冷的懸浮緩沖液分散細胞或組織碎片（把細胞懸浮于上述緩沖液是為了防止加入2XSDS凝膠加樣緩沖液時形成不溶性團塊，這一步應使用冰預冷的懸浮緩沖液而且操作應盡可能迅速，以減少蛋白質降解。大多數(shù)哺乳動物組織可以在懸浮緩沖液液面之下迅速用鑷子分開或用剪刀剪碎。）
    （2）于4℃以3000g離心5min，估算離心管底部沉淀物的體積。
    （3）吸出上清液，用連接于抽真空裝置的一次性使用吸頭把管壁上的液滴吸凈。
    （4）盡快加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液。

    [注意事項]
    PMSF 嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸人、吞進或通過皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水沖洗之，凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。PMSF在水溶液中不穩(wěn)定，應在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時，20μmol／L的PMSF水溶液的半壽期大約為35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L濃度的貯存液（1.74或17.4mg／ml溶于異丙醇中）保存于-20℃。

免疫沉淀蛋白的樣本制備

    一般情況下，粗提樣品無需進一步純化即可直接進行凝膠電泳。但下述兩種情況在免疫印跡之前，使用免疫沉淀制備蛋白的效果較好。一是含量極蛋白的檢測，由于適合凝膠電泳分辨的蛋白質總量有一定限度，通常不可能在凝膠中加入足夠量的蛋白質樣品來檢測含量極的抗原，此時可采用標準的免疫沉淀技術純化和濃縮待測蛋白；二是免疫沉淀可用來確定蛋白質與蛋白質之間的相互作用，此時，用于免疫沉淀的抗體和免疫印跡的抗體分別針對復合物中的不同蛋白質，如果清楚該復合物的性質，并知道應該使用何種抗體時，這種方法就非常有用，為研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用提供了一種有效的方法。

    [試劑與設備]
    （1）樣品緩沖液。
        Tris／Glyeine SDS—PAGE樣品緩沖液是：2％SDS，100mmol／L DTT（取自—20°C存放的lmoL／L貯存液，臨用前加入），60mmol／L Tris（pH6.8），0.01％溴酚藍和10％甘油。
    （2）水浴箱。
    （3）加樣器和吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）將樣品緩沖液加人吸附有抗原和抗體，并經過洗滌的A蛋白或C蛋白微珠中。使樣品緩沖液和微珠的體積比率至少為2：1—5：1左右更好，但一般不超過10：1.
    （2）樣品置70°C水浴加熱至少5min。除特殊情況外，在凝膠內加樣之前不必去除微珠。
    （3）樣品既可立即使用也可凍存。—20°C存放的樣品可穩(wěn)定保存數(shù)月。

    [注意事項]
    （1）對照設置：實驗對照的設置應包括能與免疫抗體共沉淀的樣品和能與非免疫抗體共沉淀的樣品。通過兩者比較可以鑒別抗體所形成的特異性條帶和非特異性條帶（例如，來自于重鏈的條帶）。此外還應該包括含有已知的或標準量的待測抗原的陽性樣品，陽性對照可以是含有已知或標準量待測抗原的任何樣品，來源于細菌或桿狀病毒超常表達系統(tǒng)或來源于已充分鑒定的細胞系。該樣品不必經過免疫沉淀但應在臨近的膠道和其他樣品同時上樣電泳。這樣能夠提示免疫印跡是否成功，并對抗原的相對分子量進行比較。如果陽性對照中抗原的量是已知的，可粗略估計待測樣品中抗原的含量。
    （2）常見問題與解決方法：有一個值得注意的問題，將免疫沉淀制備的蛋白用于免疫印跡時，來自免疫沉淀的抗體會出現(xiàn)在印跡膜上。該抗體可被二抗試劑檢出。通常抗體重鏈和輕鏈的大小并不干擾待測抗原的鑒定。然而，若待測抗原的大小在50kD或25kD左右（大約為重鏈和輕鏈多肽的大?。瑒t難以對待測抗原進行鑒定。出現(xiàn)這種情況，有兩種解決辦法：一是可將免疫沉淀抗體共價結合在A蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接檢測技術進行測定。

蛋白質凝膠電泳

    聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前對蛋白質進行分離、純度鑒定及分子量測定的主要方法之一。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子去污劑，可與蛋白質結合，使蛋白質變性并帶上大量負電荷。SDS-PAGE是zui常用的凝膠電泳技術。它通常采用不連續(xù)電泳系統(tǒng)，即用上層膠（成層膠）和下層膠（分離膠）兩種不同濃度的凝膠灌制凝膠板，見圖2.SDS-PAGE通過其電荷效應、濃縮效應和分子篩效應，達到蛋白質高分辨率的分離效果。

圖2 SDS-PAGE凝膠分層示意圖

    待分離蛋白質樣品在電泳中的泳動速度，或相對遷移率（Mr）與蛋白質本身性質（如分子大?。⒛z孔徑和電泳條件（如電流、電壓）等密切相關，蛋白質結合大量的SDS后，各組分之間的的形狀和電荷差異被抵消，此時蛋白質在電場中泳動速度的快慢，僅與各自分子量的大小有關。因此，可根據(jù)下列公式計算分子量大小:

lgMW=lgK—bMr

    其中，MW為蛋白質的分子量，K為常數(shù)，Mr為相對遷移率，b為斜率。將已知分子量的幾種標準蛋白質在電泳中的相對遷移率對其分子量的對數(shù)做圖，即可得到一條蛋白質分子量校正曲線。根據(jù)待測樣品的相對遷移率，可由校正曲線查到其分子量大小，蛋白質樣品中加SDS煮沸后，蛋白質發(fā)生變性，為保護和還原二硫鍵，尚需加還原劑2-巰基乙醇（2-ME）或二硫蘇糖醇（DTT）。蛋白質變性使亞基聚合形式存在的蛋白質解聚成單個亞基。因此，對于一個純化蛋白質，可經SDS-PAGE確定其亞基種類、數(shù)目及大小。上述蛋白質分子量測定更確切地說是蛋白質分子各亞基分子量的大小。

    丙烯酰胺凝膠孔徑對電泳速度及分離效果影響很大。凝膠孔徑的大小取決于丙烯酰胺（Aery）單體及N，N—亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）的含量及比例?？偰z濃度（T）可在3％～30％范圍內變動，T為8％～15％的凝膠，適用于大多數(shù)蛋白質樣品的分離。交聯(lián)度（C）是反映凝膠聚合情況的一個指標。凝膠聚合過程中，Acry單體之間形成延伸的多聚鏈，并通過Bis的作用，連接和交叉成網(wǎng)狀結構，zui終成為肉眼可見的凝膠。催化劑過硫酸銨（APS）和加速劑四甲基己二胺（TEMED）直接影響凝膠聚合質量。二者加量過多，會使Acry單體聚合鏈較短，聚合不充分，膠的脆性增加；反之，如加量過少，則聚合速度大大降低，甚至只出現(xiàn)所配制的膠溶液黏度稍增加、無膠狀物出現(xiàn)的現(xiàn)象。見圖3.

圖3 相對遷移率與分子量對數(shù)關系簡圖

    根據(jù)電泳的目的和要求及樣品的特點，可采取恒流或恒壓條件進行電泳。
    由于印跡技術需將蛋白質成功地從膠中轉移至膜上，因此，選擇合適的凝膠甚為重要。一般情況下，丙烯酰胺和交聯(lián)劑的比例越低，轉移就越易進行。超薄膠轉移的速度快，而且*。通常，應根據(jù)目的選擇厚度、大小均適合的凝膠。若想尋求蛋白質的*分辨力，長膠的效果較好，使較大分子量的蛋白質更好地分離。若想達到zui大的靈敏度，膠的厚度可增加到1.5mm，并且在不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白的上樣量。若主要考慮的是分離速度，則選用微型膠，厚度為0.5mm。表1顯示SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍。

表1 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

試劑與器材

    （1）Acry／Bis貯存液：29.2gAcry，0.8gBis，加60m1雙蒸水充分溶解后，再加雙蒸水至100ml。過濾后，于4℃避光保存。
    （2）分離膠緩沖液：1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8：18.15g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用1mol/L HCl調pH至8.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
    （3）成層膠緩沖液：0.5mol／L Tris-HCl，pH6.8：6.0g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用 1mol／LHCl調pH至6.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
    （4）10％APS：1.0g APS加10ml雙蒸水溶解，一20℃分裝凍存，或新鮮配制。
    （5）TEMED：原液。
    （6）10％SDS：10g SDS溶于80m1雙蒸水中，加熱攪拌至*溶解，定容至100ml。室溫保存。
    （7）50％甘油：50ml甘油加50ml雙蒸水，配成100ml溶液。
    （8）樣品緩沖液（6X）：成層膠緩沖液1.Oml，50％甘油0.8ml，10％SDS 1.6ml，2-ME0.4ml，0.05％溴酚藍0.2ml，雙蒸水4.0ml?；旌暇鶆蚝螅盅b凍存。
    （9）電極緩沖液（1X）：pH8.3：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加雙蒸水至1000ml。
    （10）蛋白質分子量標準晶：蛋白質分子量標準（高分子量和低分子量）均有商品供應。
    （11）垂直板電泳裝置：電泳槽（JM—250型，大連）。
    （12）電泳儀。
    （13）玻璃微量進樣器：加樣槍配扁而長的加樣頭亦可。

操作步驟 【動畫】

    （1）將兩塊玻璃扳組成的灌膠模具（其中一塊上口帶有凹槽，另一塊內面兩側粘有凝膠板隔離膠條，膠條厚度為0.5mm、0.75mm、1.0mm，按所需凝膠厚度選擇）洗凈、晾干，按圖4安裝好。

圖4 灌膠模具安裝示意圖

    （2）選擇合適的分離膠濃度，按表2配制所需分離膠溶液。

表2 分離膠溶液配方

    （3）將分離膠液混合后緩慢倒入玻璃板之間，并即刻在膠表面用滴管沿凝膠板內壁滴加2～3mm高的水飽和正丁醇（無水乙醇亦可），以防止空氣中的氧擴散進入膠液，影響聚合（膠液與正丁醇分界面可見清晰的折光線）。
    （4）待分離膠聚合后（約30～40分鐘），傾去表面液體，用少量分離膠緩沖液洗2～3次，多余的液體用濾紙條吸干。
    （5）配制成層膠緩沖液：3.05ml雙蒸水，0.65ml Acry／Bis液，1.25ml成層膠緩沖液，50μl 10％SDS 50μl 10％APS，5μl TEMED。總體積5.0ml，T為4％。
    （6）將成層膠液混合后，緩慢加到分離膠表面，至凹口玻璃板上緣。小心插入梳子（梳子應在步驟1安裝完畢后，預先試一下是否合適），注意排除氣泡。
    （7）30分鐘至1小時后，小心拔出梳子，去掉四周封閉乳膠管，將凝膠板與上、下電泳槽連接好。
    （8）上層電泳槽中加電極緩沖液沒過加樣孔，并用電極緩沖液沖洗加樣孔。如個別孔發(fā)生扭曲，可將玻璃微量進樣器針頭插入孔中，把孔間的短膠柱推正。
    （9）待測蛋白質溶液中按1：4比例加樣品緩沖液，如為沉淀及凍干粉，樣品緩沖液應稀釋4～5倍后加入，并使樣品充分溶解。蛋白質分子量標準按商品說明書處理。沸水浴中煮3～5分鐘后上樣。
    （10）恒壓電泳。樣品在成層膠中泳動時，電壓為100V，進入分離膠后，電壓增至150～200V（約15V／em）。為防止電泳產熱過多，應外接冷卻水裝置。
    （11）當樣品緩沖液中的溴酚藍指示劑移至凝膠底部時，終止電泳（約3小時左右）。取出凝膠板，小心將兩板之間的膠移至較大的表面皿中。此凝膠可直接進行染色觀察；亦可進一步通過免疫印跡技術，對待測蛋白質進行檢測。

注意事項

    （1）分離膠中加入少量甘油可增加膠的柔韌性，使膠不易破裂。
    （2）配制膠液時，zui后加APS和TEMED，加入后即刻使膠液充分混合，但要防止劇烈搖晃而產生氣泡。
    （3）表中所加試劑的量是依據(jù)灌制面積為14cm×l4cm，厚度為1mm的凝膠而設定，其他規(guī)格的凝膠板試劑用量可參考此表，進行適當調整。
    （4）Acry、Bis具有神經毒性，實驗中應帶手套操作。
    （5）可選用恒流條件進行電泳，如：樣品在成層膠中泳動時，電流為30mA，進入分離膠后，電流增加至40mA；亦可以4～5mA低電流，電泳過夜，次日增加電流至10～12mA 5～10分鐘，以改善樣品的少量擴散。
    （6）待分離樣品的質、量直接影響電泳效果，如：若電泳出現(xiàn)波浪線，則說明上樣量過多，應減少上樣量；若樣品中含鹽濃度過高，應先透析，以便除掉鹽分；若樣品黏度過大（如細胞蛋白質），先用超聲波破碎染色體DNA后再電泳。
    （7）如果待分離樣品中蛋白質組分分子量的變化幅度大，則應考慮用梯度發(fā)生器制備5％～20％的梯度膠，以達到滿意的分離效果。
基本原理 【動畫】

    電泳后蛋白質樣品轉移的方法，包括半干式轉移、濕式轉移等。各種轉移方法原理相似，都是將膜與膠放在中間，上下加濾紙數(shù)層，做成"Sandwich”樣的轉移單位，并且保證帶負電的蛋白質向陽極轉移，即膜側連接陽極或面向陽極（連接方式如圖5所示）。

圖5 轉移單位示意圖

    可用于免疫印跡的固相載體有多種，硝酸纖維素膜、尼龍膜、帶正電荷的尼龍膜及PVDF（聚亞乙烯雙氧化物）膜。硝酸纖維素膜zui為常用，具有結合能力強，膜不需要活化，背景淺，能進行多次免疫檢測并可用常規(guī)染色方法，功能基團壽命長等優(yōu)點，但極易破碎不易操作。尼龍膜軟且結實，較硝酸纖維素膜易操作，具有與蛋白質或蛋白質-去污劑混合物有很高的結合力，每平方厘米可結合480pg蛋白（而硝酸纖維素膜只能結合80Pg），因此靈敏度高，背景也高，因為其高電荷密度使對其非結合區(qū)進行封閉較為困難。帶正電荷的尼龍膜能有效地結合低濃度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，當轉印液中有SDS時，蛋白質容易從膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白質在尼龍膜上的保留指數(shù)。PVDF膜在制備多肽供蛋白質化學分析中zui為常用。在進行蛋白水解和序列分析時，通常是先將蛋白質結合在PVDF膜上。

    將凝膠中的蛋白質轉印至膜上的方法很多。目前常用方法是電洗脫或電印跡。其主要優(yōu)點是轉印迅速、*。電洗脫有兩種方法：一種是濕轉印法，即將凝膠-膜夾層組合*浸入轉印緩沖液中；另一種是半干轉印法，即將凝膠-膜夾層組合放在浸有轉印緩沖液的吸水紙之間。前者是將夾層組合放人有鉑絲電極的緩沖液槽中。而后者是將凝膠-膜夾層組合置于兩個石墨平板電極之間。這兩種轉印的裝置效果均較好，可根據(jù)實驗室條件來選擇。

試劑與器材

    （1）電泳凝膠。
    （2）轉移緩沖液：pH8.1—8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加雙蒸水定容至1000ml。
    （3）TBS緩沖液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl調pH至7.4，加水定容至1000ml。
    （4）TTBS緩沖液：在TBS中加入Tween—20，濃度為0.1％，4℃保存1個月。
    （5）封閉液：1.5g脫脂奶粉溶于50ml TTBS中，現(xiàn)用現(xiàn)配（用1％～3％的BSA，或10％胎牛血清亦可）。
    （6）特異單克隆抗體：用封閉液適當稀釋。
    （7）酶標第二抗體：辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）標記。
    （8）蛋白質轉印膜：NC（硝酸纖維素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龍膜等均可。
    （9）顯色底物。
    （10）恒溫振蕩器。
    （11）半干式電泳凝膠轉移儀。
    （12）Whatman 3mm濾紙。
    （13）手套。
    （14）孵育及顯色用塑料盒。
    （15）塑料袋。
    （16）塑料封口機

操作步驟（半干式轉移）

    1.轉移
    （1）電泳后的凝膠先切除成層膠及需要進行凝膠直接染色的孔道部分，并將膠剪一小角作為定位標記，然后放在轉移緩沖液中平衡30分鐘左右。
    （2）將轉印膜1張及6張Whatman濾紙剪成與膠同樣大小。轉印膜用前需在轉移緩沖液中平衡10～15分鐘，濾紙用前在轉移緩沖液中浸濕即可。
    （3）由下至上將3層濾紙、膜、凝膠及3層濾紙依次放好。每放一層都應注意排除氣泡。如有氣泡，可用光滑的玻璃棒或試管在各表面緩慢滾動，予以排除。
    （4）將轉移裝置連接好，接通電源。恒流下轉移，0.8mA／cm2，轉移30分鐘至1小時。
    （5）關閉電源，取出膜，然后用雙蒸水漂洗l～2分鐘，放在濾紙中干燥備用。注意膜上要做好標記。

    2．檢測
    （1）將膜放在塑料盒中，加入適量封閉液，于37℃恒溫振蕩器上放置1小時，或4℃過夜。
    （2）將膜轉入塑料袋中，加入用封閉液稀釋的*抗體，于37℃或室溫孵育反應1小時。
    （3）剪開塑料袋，傾去*抗體液體，用鑷子將膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分鐘。
    （4）加入稀釋好的酶標第二抗體，繼續(xù)在37℃或室溫孵育反應30分鐘至1小時。
    （5）同步驟（3），洗膜。
    （6）加底物顯色液。此步驟一般要求避光進行。即時檢查一下，以控制顯色程度，防止本底過高及出現(xiàn)非特異條帶。
    （7）終止反應，用雙蒸水大量沖洗，然后將膜放于雙層濾紙中干燥保存。

注意事項

    （1）如采用PVDF膜，使用前應在甲醇中浸泡一下，再移至轉移緩沖液中平衡。另外，PVDF膜在檢測時，采用TTBS緩沖液。
    （2）電泳凝膠一般可重復轉移1次，以獲得兩張相同的膜，第2次轉移的時間可略延長。
    （3）如待分析的蛋白質分子量大，轉移時間也需延長。
    （4）上述顯色檢測方法僅給出了基本步驟，采用不同檢測系統(tǒng)，需按廠家說明書具體操作。
    （5）電泳轉移操作時，保證濾紙、膜、凝膠其間無氣泡存在是實驗的關鍵步驟。因即或有微小的氣泡殘留，電泳時局部溫度升高，氣泡膨脹會嚴重影響印跡結果。

轉印后切取印跡膜

   有時轉印后需將印跡剪成較小的片狀進行單獨處理。單個泳道可以泳動同一樣品，待彼此分開后，可用不同的抗體并列檢測。如以電泳方向剪膜，就可在同一樣品中檢測不同分子大小的抗原。為了簡便而地找到泳道，電泳之后用麗春紅S（Ponceaus S）或印度墨汁對印跡膜進行染色，便可很快確定待測蛋白質的位置并將其剪下。表3表明兩種染料的適用范圍及優(yōu)缺點，用麗春紅S染色的優(yōu)點是操作簡便，價廉和具有可逆性，在封閉過程中，染色易消褪，且不干擾進一步的檢測。

    在某些情況下，可能想用印跡中的較高分子量區(qū)域來檢測一種抗原，用另一個區(qū)域來檢測另一不同分子量的蛋白質。為了使印跡中不同的區(qū)域正好對應于相應分子量的范圍，這需要在對照泳道中加入已知分子量的蛋白質。這樣可方便地在印跡中找到適當?shù)膮^(qū)域并將其剪下。

    使用預染的分子量標記，可為轉印后切下所需印跡提供良好的指示，此類標記已商品化，但是比麗春紅S染色法昂貴。標記中的顏色除了增加成本對實驗并無不良影響，而且在泳動時非常漂亮。

表3 用于免疫印跡染色的染料

印跡膜蛋白染色

    [所需試劑]
    （1）2％麗春紅S濃貯存液（3-羥基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7—萘二磺酸）：溶于30％三氯醋酸和30％磺基水楊酸中。貯存液可在室溫下穩(wěn)定存放1年以上。
    （2）PBS。

    [操作步驟]
    （1）在染色之前，先配制麗春紅S的應用液。即將2％的麗春紅S濃貯存液用1％醋酸1:10稀釋即成為應用液（注意：如果使用硝酸纖維膜，須將麗春紅S應用液更換為用水1:10稀釋）。
    （2）用麗春紅S應用液將PVDF膜洗1次。
    （3）加入新鮮稀釋的麗春紅S應用液，并在室溫下攪動5～lOmin。
    （4）將PVDF膜放人PBS中漂洗數(shù)次，每次1～2min，并更換PBS。
    （5）根據(jù)需要將轉印部位和分子量標準位置進行標記，至此PVDF膜可用于封閉和加入抗體。

 

    免疫檢測主要取決于抗原抗體的特異性，特別是能夠識別膜上變性的和固定化抗原的抗體。因印跡膜上有非特異性吸附蛋白質的位點，因此需進行封閉以防免疫試劑的非特異性吸附。將印跡膜與一定濃度的不參與特異性反應蛋白質或去污劑溶液孵育可實現(xiàn)封閉。然后通過抗體與膜上抗原的特異性結合來定位抗原。抗原可用易觀察的標記的抗體進行檢測。抗體本身可以標記，直接用于檢測抗原，但更為常見的是，使用的抗體是非標記的，而用標記的二抗采進行抗原定位。

    常用的標記方法有酶聯(lián)法，一般是用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，具體的介紹見本書第四章“免疫標記技術”。近年來，化學發(fā)光（CL）法已成為常用的方法之一。該法是基于環(huán)化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化學氧化作用，生成一種不穩(wěn)定的中間產物，當其衰變時即可發(fā)光。發(fā)出的光可使標準X-光片感光，產生較易識別的圖像。化學發(fā)光法比過去使用的顯色或放射活性檢測法更加靈敏。盡管對靈敏度增加的幅度還有很多爭論，但一般認為比顯色法大約增加20倍，比放射活性檢測方法約增高 7倍。該法的關鍵是使用了辣根過氧化物酶偶聯(lián)物作為二抗或二級試劑。辣根過氧化物酶可與抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白C或其他可與一抗特異結合的試劑共價結合。在過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶催化魯米諾（氨基苯二酰一肼）氧化后即可發(fā)光。

    除了蛋白質樣品的電泳分離過程之外，在進行免疫印跡操作之前，還考慮下面兩個問題。

印跡膜上非特異性蛋白質結合位點的封閉

    表4 總結了常用的封閉液及其優(yōu)缺點。盡管這些封閉液在某些情況下使用較為滿意，但是仍需要仔細選擇以確保其能適合于檢測試劑。幾乎適合于所有檢測系統(tǒng)的兩種封閉緩沖液是脫脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白質封閉液造成本底過高或干擾檢測，則可試用吐溫20封閉液。

表4 常用的封閉液

*若不愿每次新鮮配制封閉緩沖液，應加入0.01%硫柳汞制劑作為防腐劑。避免使用*，因其能抑制辣根過氧化物酶的活性。
 

直接與間接檢測方法

    直接法是指用標記的*抗體（一抗）來進行檢測的方法，用這種類型的抗體對膜上抗原進行免疫檢測的本底較低，并且在同一張印跡膜上可同時使用來源或特異性不同的多種抗體，但靈敏度不如間接法。間接檢測是指先使用非標記的一抗，然后用可與一抗結合的標記第二抗體（二抗）進行檢測的方法。由于二抗分子是多價的，具有放大效應，因而靈敏度較高。因此，除非需要直接檢測抗原的特異性，否則是選擇間接法進行免疫印跡測定。通常選用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白抗體商品試劑來檢測一抗，分別針對不同種屬來源的一抗。這樣，一個實驗室只需備用針對小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少數(shù)幾種通用試劑即可滿足各種免疫印跡實驗要求。

    下面以間接檢測法為例介紹免疫檢測的方法。

間接檢測法 

    [準備工作]
    在準備做抗原檢測時，須考慮所用一抗和二抗的*濃度，對不同來源的抗體，其特異性林的濃度都不相同。因此，對一抗體進行滴定有助于確定*反應比例，預先滴定二抗對實也有幫助，一旦確定*濃度，則每次印跡即可用同一批一抗、二抗來完成。多數(shù)情況下可用商家提供的濃度進行檢測。

    [材料與試劑]
    （1）PBS：稱取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸餾水800ml，用HCl調節(jié)溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。
    （2）封閉液（見表4）。
    （3）1%BSA/PBS。
    （4）一抗試劑和堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的二抗試劑（通常是用辣根過氧化物酶標記的抗免疫球蛋白抗體）。
    （5）堿性磷酸酶底物溶液:
        1）NBT（氮藍四唑）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5gNBT。
        2）BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5g BCIP。
        3）堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／LNaCl；5mmol／L MgCl2；100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），置密閉容器中保存，此溶液穩(wěn)定。
        4）取66rdNBT溶液與10ml堿性磷酸酶緩沖液混勻，加入33plBCIP溶液。
        5）辣根過氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol／L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3—3，—二氨基聯(lián)苯胺，加入lml 0.3％（w／v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl號濾紙過濾以除去沉淀，加入10yB0％H202混勻后立即使用。此溶液須在臨用時配制。

    [操作方法]
    （1）用PBS漂洗印跡膜數(shù)次。
    （2）加入一種封閉液（見表4）。注意：不同的抗原和實驗方法需用不同的封閉緩沖液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特異性抗磷酸化酪氨酸抗體進行實驗時，這會給解釋實驗結果造成一定的混淆，也給親合素／鏈霉親合素檢測的應用帶來一些問題。某些牛奶制品可抑制堿性磷酸酶的活性。若無信號或檢測背景較高，則需嘗試不同的封閉緩沖液。
    （3）室溫下攪動孵育。一般孵育20min～2h或4℃過夜較好。
    （4）從封閉緩沖液中取出印跡膜，用PBS漂洗3次，每次5min。
    （5）加入工作濃度的一抗溶液。每張15X15cm的印跡膜用量為10ml。所有的稀釋液均用含有蛋白質的溶液，例如1％BSA／PBS。孵育可在淺盤或塑料袋中進行。在室溫下將抗體和印跡膜攪動孵育至少1h。有人認為4℃孵育過夜（12～18h）可提高靈敏度。
    （6）用PBS漂洗印跡膜4次，每次換液洗5min。 ，
    （7）此時，印跡膜便可加人工作濃度的標記的二抗溶液。可在淺盤或塑料袋中室溫孵育1h。抗體用含有蛋白質的溶液進行稀釋，例如 1％BSA／PBS。商品化的酶標二抗應在0.5～5μl／ml濃度之間使用（通常將商品試劑原液稀釋成1：200～1:2000的應用液）。用辣根過氧化物酶標記的試劑
須用不含疊氮鈉的封閉液稀釋。
    （8）用PBS漂洗印跡膜4次，每次換液洗5min。
    （9）將經漂洗的印跡膜移至另一干凈淺盤中，按印跡膜面積加入0.lml／cm2的底物溶液（若使用堿性磷酸酶標記的二抗，用堿性磷酸酶底物溶液，若用辣根過氧化物酶標記的二抗則用辣根過氧化物酶底物溶液），于室溫輕輕搖動，待蛋白條帶的顏色深度達到要求（約2-20min），用水略為漂洗，放人PBS中。
    （10）拍攝照片，留作*實驗記錄（過氧化物酶染色的蛋白條帶經日光照射數(shù)小時后顏色將退去）。
 

抗體的性質

    影響免疫印跡成敗的一個主要因素是抗原分子中可被抗體識別的表位的性質。只有那些能識別耐變性表位的抗體可與抗原結合。多數(shù)多克隆抗血清中或多或少地含有這種類型的抗體，所以在免疫印跡實驗中常選用多克隆抗體。相反，許多單克隆抗體不能與變性抗原反應，因為它識別的表位依賴于抗原蛋白正確折疊所形成的三維空間構象。表5顯示各種抗體的優(yōu)缺點。

表5 抗體的選擇

 

 

 

 

印跡法操作流程

印跡法實驗膜條 溫育槽
樣品緩沖液 加樣 : 1.5ml/ 槽 *
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 5 分鐘 *
吸干 *
已稀釋的樣本 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 30 分鐘
清洗緩沖液 清洗 : 1.5ml 緩沖液 溫育 5 分鐘 吸干
酶結合物 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 30 分鐘
清洗緩沖液 清洗 : 1.5ml 緩沖液 溫育 5 分鐘 吸干
色原 / 底物液 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 10 分鐘
清洗 : 蒸餾水浸洗 吸干
結果判斷 : 肉眼判斷結果