蛋白質(zhì)分析技術(shù)(Western Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術(shù))

1 原理：
將通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時(shí)間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無(wú)特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過(guò)條帶的密度大小來(lái)進(jìn)行特異性蛋白的半定量。

2 操作過(guò)程
SDS-PAGE電泳→轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）
封閉→一抗→洗滌→酶標(biāo)二抗反應(yīng)
洗滌→顯色或化學(xué)發(fā)光顯影


Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8
and 16 h. After treatment, cells were harvestedlysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lanethe expression of actin was detected as a loading control.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosolmitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.


3 注意的問(wèn)題
（1） 蛋白質(zhì)電泳
常用SDS-PAGE：?jiǎn)我粊喕M成的蛋白質(zhì)
非變性PAGE：多個(gè)不同亞基組成的蛋白質(zhì)
Tris-Tricine膠中電泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。
（2）轉(zhuǎn)膜
戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致
以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜15－30min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。
方向正確：凝膠在陰極，膜在陽(yáng)極
排去濾紙、膠和膜間的氣泡。
電轉(zhuǎn)時(shí)間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置
（3）封閉
用5％脫脂奶粉或3％BSA
（含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）
時(shí)間：室溫2h或4ºC過(guò)夜
（4）顯色或顯影
顯色
辣根過(guò)氧化物酶：底物為DAB
堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT
化學(xué)發(fā)光顯影
zui常用。辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）
注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定
（5）膜的再利用
化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping －2ME ）Buffer洗滌后（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的 用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用3－4次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進(jìn)行雜交
二、ELISA
1 原理：
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根過(guò)氧化物酶，底物為OPD, 深桔黃色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm
TMB， 藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm
堿性磷酸酶，底物為PNPP（對(duì)－消基苯磷酸酯）, 黃色
檢測(cè)波長(zhǎng)405nm
ELISA各步驟的反應(yīng)時(shí)間
包被：24－36h，蛋白濃度為1－5ug/ml
封閉：37ºC 2h 或4ºC過(guò)夜（3％BSA）
樣本反應(yīng)時(shí)間：37ºC 45min-1h
酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間： 37ºC 45min-1h
顯色時(shí)間：15min(避光）
設(shè)對(duì)照
可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆?br />2 類型
（1）間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測(cè)。


(2) 雙抗體夾心法測(cè)抗原
是檢測(cè)抗原zui常用的方法。
只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
常用的組合：?jiǎn)慰寺】贵w＋多克隆抗體
單克隆抗體＋單克隆抗體
后一組合是兩種單克隆抗體針對(duì)抗原上不同的相距較遠(yuǎn)的兩個(gè)抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。
用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。例如各種細(xì)胞因子的檢測(cè)。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：
捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測(cè)抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS)→酶標(biāo)單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測(cè)
(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
1）抗體固相測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。
其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法：抗體包被→封閉→同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原→洗滌→酶底物→顯色→ELISA reader檢測(cè)
2）抗原固相測(cè)抗原
其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，zui后的顯色也愈淺。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封閉;
c: 待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間； d: 加入96孔板
e: 洗滌 f：加入酶標(biāo)二抗
g：洗滌 h：顯色和檢測(cè)

（4）IgM抗體的檢測(cè)
1）間接法：
間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定血清中的IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部分IgM抗體不能結(jié)合到固相上，將出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 因此，如果用抗IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。
 

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