細(xì)胞培養(yǎng)中死活細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要測(cè)定細(xì)胞的存活率以了解細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，鑒定細(xì)胞存活常用的方法有染色法和儀器分析法。染色法可直接通過細(xì)胞形態(tài)，區(qū)別細(xì)胞死亡，它是一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞存活鑒定方法。這里總結(jié)下死活細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

（一）染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便，易于操作。實(shí)驗(yàn)是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行的。死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要體現(xiàn)在：

（1）死活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過;而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損，通透性增加。

（2）死活細(xì)胞在代謝上的差異：由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，而死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們的無(wú)還原能力或還原能力極弱。

常見的細(xì)胞染料有：中性紅（細(xì)胞器的專有染料）、臺(tái)盼藍(lán)、甲基藍(lán)、美藍(lán)、熒光素雙醋酸酯（FDA）等。

① 中性紅染色：常用染料之一，是細(xì)胞器的專有染料。利用細(xì)胞膜的通透性差異，用來(lái)染原生動(dòng)物和顯示動(dòng)植物組織中活細(xì)胞的內(nèi)含物等。中性紅無(wú)毒，常做活體染色的染料。

② 臺(tái)盼藍(lán)染色：當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。嚴(yán)格來(lái)說，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)的是細(xì)胞膜的完整性，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。通過顯微鏡很容易就能識(shí)別出死亡的被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞，并可使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。

③ 美藍(lán)染色法：美藍(lán)是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無(wú)色的，用它來(lái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以活細(xì)胞無(wú)色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞.

④ 甲基藍(lán)染色法：甲基藍(lán)染色與臺(tái)盼藍(lán)類似的染色機(jī)理。

（二）植物細(xì)胞質(zhì)壁分離法及活體染色測(cè)定細(xì)胞死活

（1）質(zhì)壁分離法：成長(zhǎng)的植物細(xì)胞一般具有*液泡，在*液泡和細(xì)胞壁之間為細(xì)胞質(zhì)的薄層及其內(nèi)外膜——液泡膜和質(zhì)膜。液泡中的胞液具有一定的溶質(zhì)勢(shì)（或稱滲透勢(shì)），而活的原生質(zhì)特別是液泡膜和質(zhì)膜則具有半透性。所以，當(dāng)細(xì)胞與外界溶液接觸時(shí)，便與外液構(gòu)成滲透系統(tǒng)，并可能發(fā)生水分的移動(dòng)。若外液的水勢(shì)低于胞液的溶質(zhì)勢(shì)，則水分外滲的結(jié)果可使原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而脫離細(xì)胞壁，發(fā)生質(zhì)壁分離，質(zhì)壁分離的細(xì)胞與水或水勢(shì)較高的溶液接觸時(shí)，可重新吸水而是質(zhì)壁分離復(fù)原。

（2）活體染色法：活體染色是利用某種對(duì)植物無(wú)害的染料稀溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色技術(shù)。中性紅是常用的染料之一，它是一種弱堿性pH6.4～8.0之間（由紅變黃），在中性或微堿性環(huán)境中，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)，因此，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽(yáng)離子而呈現(xiàn)桃紅色。在這種情況下，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色。死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固，胞液不能維持在液泡內(nèi)，因此，用中性紅染色后，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，相反，中性紅的陽(yáng)離子卻與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1、 試劑的配置：

① 臺(tái)盼藍(lán)：4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾，4度保存。使用時(shí)。用PBS稀釋至0.4%。

② 中性紅：先配成1%中性紅水溶液（1克中性紅溶于100毫升蒸餾水中）。取這種溶液1毫升，用0.6%生理鹽水（或蒸餾水）稀釋到50毫升，即成0.02%中性紅水溶液，貯存在棕色瓶里，放在黑暗處。

③ 美藍(lán)：取0.5克美藍(lán)，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氫氧化鉀溶液，保存在棕色瓶?jī)?nèi)。此溶液能染細(xì)胞核，還用來(lái)染細(xì)菌、血和神經(jīng)組織等。

④ 甲基藍(lán)：取1克甲基藍(lán)，溶于29毫升70%酒精中，加入70毫升蒸餾水，即成1%甲基藍(lán)染液。

2、 染色操作步驟：略

3、 細(xì)胞活力測(cè)定：染色過的細(xì)胞材料，放在顯微鏡下觀察。凡未染或染色及淺的細(xì)胞是有活力的，而染色深的細(xì)胞是無(wú)活力的死細(xì)胞。

4、 按公式計(jì)算出細(xì)胞活力。 細(xì)胞活力（%）=未染色的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù) X 100%

【注意事項(xiàng)】

1. 臺(tái)盼藍(lán)對(duì)人體有毒

2. 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，時(shí)間不宜過長(zhǎng)。否則，部分活細(xì)胞也會(huì)著色，會(huì)干擾計(jì)數(shù)。