iCell-CRO04 MTT法細(xì)胞活性檢測(cè)

MTT檢測(cè)法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)增殖的方法。
檢測(cè)原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)（或其他波長(zhǎng)）處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。
該方法靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及細(xì)胞放射敏感性測(cè)定等等。

MTT主要有兩個(gè)用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定；（2）細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

MTT法細(xì)胞活性檢測(cè)

MTT方法能簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)胞的增殖反應(yīng)，并且其價(jià)格低廉，成為日前各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)胞活性的shou選方法之一。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（OD值）來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?/p>

一、MTT 溶液的配制

1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml，須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg，250mg或1g。對(duì)于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法：預(yù)先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT*混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長(zhǎng)期保存于-20℃。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計(jì)算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml。對(duì)于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。

2、注意事項(xiàng)：

（1）在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感。

（3）MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用時(shí)需小心。

MTT法細(xì)胞活性檢測(cè)

二、MTT甲瓚溶解液

1、二甲基亞砜DMSO：可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對(duì)人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會(huì)把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。

2、三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。

三、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟

1、yi酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。

2、將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。

注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間*相同，這對(duì)于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。

3、將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物。原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥（兩小時(shí)——半天時(shí)間），但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔，建議設(shè)6個(gè)，否則難以反應(yīng)真shi情況。

注意：對(duì)于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細(xì)胞死亡。

4、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。

6、終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。

溶解結(jié)晶的方法有兩種，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙?jiān)谧烂妫缓髮?6孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

另一種方法，用三聯(lián)溶解液：

1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）

2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測(cè)吸光度。通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些。

7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

四、MTT結(jié)果分析

關(guān)于如何計(jì)算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 大劑量

I：lg(大劑量/相臨劑量)

P0：陽性反應(yīng)率之和

Pm：大陽性反應(yīng)率

Pn：小陽性反應(yīng)率